多重PCR检测肉及其肉制品中四种食源性致病菌研析.pdfVIP

摘要 食品安全突发事件频率高是近年来食品安全问题的一个显著特点，在各种食品安 全事件中，细菌性食物中毒则是食物中毒的重要因素。常见的食源性致病菌主要有金 黄色葡萄球菌、沙门氏茵、志贺氏菌、单核增生李斯特氏菌、致泻性大肠杆菌等。目 前，国内检测食品中致病菌主要采用传统的培养方法，其操作繁琐，检测时间较长， 通常需要3～5d才能完成，且灵敏度较低。近年来，PCR针对某一种或一类致病菌的 检验方法被建立起来，但是一旦检测的方向有误就会造成时间和药品的浪费。因此， 急需建立一种快速有效且通量较高的检测方法。 本文根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因万甜c、沙门氏菌的侵染性质粒抗原B 基因ipaB、志贺氏菌的侵染性质粒抗原H基因ipaH,单核增生李斯特氏菌的内化素 A基因加从设计了四对特异性引物，进行多重PCR反应，可同时实现对四种食源性 致病菌的检测。试验过程中对多重PCR反应体系中引物添加量、镁离子浓度、dNTP mixture添加量及退火温度和循环数等影响要素进行优化，确定了适宜的多重PCR反 10xPCR 25mmol／L 应体系和扩增程序，其反应体系为：59L buffer,3．5pL M92+，5．59L 94。C预变性5min，94℃变性1rain，55．5℃退火45S，72℃延伸f商“．35个循环， 72℃终延伸5rain,反应产物在l％的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统观察结果。 从而证实PCR扩增产物确为目的扩增产物。 本研究共检测了20株菌，2株金黄色葡萄球菌、4株沙门氏菌、4株志贺氏菌、 l株单核增生李斯特氏菌均为阳性结果；9株其它肠杆菌均为阴性结果。将四种致病 茵随机组合，均能够准确检测出结果，因此该多重PCR反应特异性较强。 本方法对四种食源性致病菌的纯菌培养物单茵检测灵敏度均为10‘cfu／mL：同时 cfu／mL、沙门氏菌102cfu／mL、 检测四种食源性致病菌的灵敏度金黄色葡萄球菌为102 cfu／mL。 志贺氏菌101cfu／mL、单核增生李斯特氏菌101 对实际样品进行检测，将多重PCR方法与国标进行比较，确定多重PCR方法对 四种致病菌的敏感性均为100％：特异性分别为：金黄色葡萄球菌为95．5％、沙门氏 菌为95．7％、志贺氏菌为91．3％、单核增生李斯特氏菌为94．1％；符合率分别为98％、 98％、96％、94％。 本方法使用FTA滤膜处理样品，再通过多重PCR方法同时检测人工污染肉及肉 制品中四种致病菌，金黄色葡萄球菌检出限为102c血倌、沙门氏菌检出限为102cfh值、 志贺氏菌检出限为101cfIl儋、单核增生李斯特氏菌检出限为101cfu／g。并且检测可 以在6h内完成，大大缩短了检测时间。为多重PCR快速检测食品中四种食源性致 病菌构建了一个技术平台。 关键词：多重PCR：FTA滤膜；检测；肉；致病菌 PCR forDetectionoffourfood-borneBacterial inmeat Assay Multiplex Pathogens sample Author：YangOuoxing Wei Supervisor：Zhang Major：Microbiology Abstract Food are inrecent these safetyemergencieshighfrequency years．Inproblems，the ofBacterial themost data food