几种dna甲基检测方法及其应用.pdf

摘 要 中文摘要 论文题目t几种DNA甲基化检测方法及其应用 博士研究生：侯鹏 导师姓名：陆祖宏教授 学校名称：东南大学 DNA甲基化是细胞的一种表观遗传现象，在细胞分化、发育及增殖过程中起着十分重 要的作用。肿瘤细胞中基因组总体甲基化水平的降低和某些基因启动子区发生过甲基化是肿 瘤最早，也是最常见的分子改变之一。异常DNA甲基化通常发生在CG密集区，称之为CpG 岛，通常位于基因的控制区及第一外显子区。异常DNA甲基化与肿瘤抑制基因的转录失活 密切相关，这种现象在肿瘤中非常普遍。因此。异常DNA甲基化的检测可以作为肿瘤诊断 和预后的一个有用的分子标记。近年来相关的研究方法发展迅速，本文旨在发展几种DNA 甲基化分析新方法，特别是高灵敏、高通量的分析方法。 基因芯片的出现为DNA甲基化的高通量检测提供了技术平台。但是，与基因表达、SNP 等生物芯片的研究进展相比，DNA甲基化检测芯片的研究近几年刚刚开始。目前国际上只 有少数几个研究小组(如哈佛大学、密西根大学、英国sanger中心及东南大学等)开展DNA 甲基化芯片的研究。我们发展了兰种甲基化芯片用于甲基化DNA的检测。 p16基因是一个典型的抑癌基因，它的失活与肿瘤的发生发展密切相关。而CpO岛异 常甲基化则是导致p16表达缺失的一个重要途径。研究表明在肿瘤的每个时期都能发现p16 基因异常甲基化，这说明p16基因异常甲基化是肿瘤发生中一个早期事件。因此，肿瘤相关 基因的异常甲基化检测对于肿瘤的早期诊断与预后具有非常重要的临床意义。因此。本论文 大部分工作以p16基因为研究对象开展研究。本论文具体内容如下： 1．半巢式MSP(甲基化特异性PCR)在胃癌p16基因甲基化检测中的应用 采用半巢式MSP成功检测60例胃癌组织及相应正常组织中p16基因甲基化的状态，并 用免疫组化的方法研究了胃癌样本中p16蛋白的表达与甲基化的关系。结果表明，较现在常 用的MSP，半巢式MSP能提高肿瘤样品中p16基因甲基化的检出率，p16基因的甲基化检 出率由42．9／o提高到60．7％。而且，在胃癌的各个时期均能发现p16基因甲基化，这一现象 进一步证实了表遗传改变可能是胃癌发生中一个早期事件。 2．DNA甲基化的电化学检测 我们以典型的抑癌基因p16为研究对象，发展了一种电化学检测DNA甲基化的技术， 该技术具有很高的灵敏度。具体如下：首先，将来自胃癌组织及正常人外周血的基因组DNA 经内切酶MseI(Tr*AA)消化成短片段，但CG密集区却保持完整。酶切产物纯化后连接 I酶 通用的连接予，作为PCR扩增时的引物；其次，连接产物经甲基化敏感性内切酶西m 解，未甲基化的连接产物被切断，经PCR扩增得不到产物，而甲基化的连接产物保持完整。 经PCR扩增后能得到产物：最后，根据p16的序列设计互补的探针，将其固定于经过修饰 的金电极上构成一个电化学生物转感器。PCR产物与电极在一个潮湿的条件下杂交，并且 V 东南大学 博。卜学位论文 法对杂交结果进行检测。结果表明CV和SWV都能很好地在胃癌绸织中检测出DNA甲基 化．且swV较CV有更高的灵敏度。上述的结果经甲基化特异性PCR(MSP)及测序进行 验证。 3．用于甲基化模式分析的基因芯片 本文提山了一种能分析甲基化模式的DNA微阵列技术。我们选取人类p16基因51端启 动子和第。乡}显子区的一部分为研究对象，该部分包含32个CpG位点，我们选取其中的7 个相邻CpG位点，并根据这些干}7=点设计一个DNA微阵列，以检测所有可能存在的甲基化模 式，并且_|=#I该微阵列检测了舯瘤样品中p16基因的甲基化模式。结果表踢，该微阵列能准确 地判断p16基因中这7个CpG位点的甲基化模式，而且微阵列结果经MSP法和测序验证。 冈此．该微阵列可以作为一种新型的DNA甲基化模式的分析上具。 4．用于多基因甲基化分析的基因芯片 异常DNA甲基化的检测可以作为肿瘤诊断和预后的一个有用的分子标记。然而，日前 的人多数1作都集中丁单个或少数的基因的研究，很难给出较为全面的信息，冈为在肿瘤发 生发展的过程中，