利用农杆菌介导鉴定nthk1基因功能及其遗传转化.pdfVIP

摘 要 摘 要 NTHKl是从烟草中克隆出来的乙烯受体基因，能被机械损伤，NaCI和PEG诱导，这说 明NTHKl可能参与了盐和干旱的信号传递过程。所以，NTHKl可能与多种逆境胁迫有关。 由于NTHKl基因的功能在大豆中还没有确认。为便于在人豆转基冈育种中应用，首先要在 大豆中验证其功能。 实验结果表明： 1．构建了发根农杆菌和根癌农杆菌两个表达载体，并利用BamHl和Notl酶切验证了构 建的止确性。 2．采用低浓度(0．101和0．213)的菌液进行侵染发根较为合适，既可保证产生毛状根的 数量，又可以保证有较高的转化率。 3．通过PCR，RT-PCR检测分析及GUS基冈的染色、切片，表明基因整合到植物组织中 并有较高的活性。 4．界定了潮霉素筛选毛状根的临界浓度为10mg／L。 5．将利用潮霉素筛选过毛状根置于不同NaCl浓度处理，发现随NaCI浓度的增加，转化 根及：{F转化根的生根数鼍逐渐减少，并且相同浓度下的转化根比非转化根的长势好。通过不 同浓度下转基冈毛状根和对照的水分测定，表明在盐分胁迫下，相同NaCI浓度F转基因毛 状根的吸水量比对照多，可以起到稀释植物体内盐分的作用，以此米降低盐分胁迫对植株的 危害。因此，NTHKl基因有耐盐功能。在室外对大豆植株进行耐盐性鉴定，表明具有转基因 毛状根的大豆植株在低浓度时比相同浓度的对照植株更具耐盐性；但在高浓度时，二者无明 显区别。通过对根系活力、脯氨酸含量、丙-二醛含量的测定，表明根系活力随NaCl浓度的 增加而逐渐降低，而脯氨酸含量和丙二醛含量随NaCI浓度的增加而逐渐升高。通过对过氧 化物同』：酶活性的检测，表明随NaCI浓度的增加过氧化物同工酶活性增加。 6．用PEG筛选的毛状根无表型变化。但是通过不同浓度下转基冈毛状根和对照的水分测 定，表明各浓度下转基冈毛状根的含水量均明显高于或略高于对照，这说明在干早胁迫下， 相同PEG浓度下转基因毛状根的吸水量比对照多，通过吸收较多的水分米降低干早胁迫对植 株的危害，起剑抗旱功能。 综上所述，NTHKl基冈住大豆中具有一定的耐盐(抗盐)性和耐旱(抗旱)性。 另外，本研究还以子叶节为外植体、利用农杆菌介导法对人豆进行遗传转化，以期获得 转基冈大豆植株。共获得转化大豆植株15棵。通过草丁膦抗性实验和PCR检测分析，有3 棵植株旱现阳性，初步证明了NTHKl基因整合到基囚组中并且有效表达，从而为进一步获 得抗逆性的转基因大豆品种奠定了基础。 关键词：发根农杆菌；根癌农杆菌；毛状根；遗传转化；耐盐；耐早 ．VII． Abstract the FunctionoftheNTHKlGeneand Identify Transformationwith in Agrobacteriurn-—mediatedSoybean Abstract NTHKlisclonedfromtobaccoasan andcouldbeinduced ethylenereceptor bydamage，NaCI and PEG．Itseemsto inthe transfer ofsaltand signal stresses．Thus， participate process drought NTHKIrelateto adverse the might many conditions．Andthefunctionof isnotaffirmedinthe