茯苓菌丝体胞外多糖硫酸酯化工艺的研究.pdfVIP

第 12卷 第 1期 太 原 师 范 学 院 学 报 (自然科学版) Vo1．12 No．1 2013年 3月 JOURNALOFTAIYUANNORMALUNIVERSITY (NaturalScienceEdition) Mar．2013 茯苓菌丝体胞外多糖硫酸酯化工艺的研究 韩 勇 (山西药科职业学院，山西 太原 030031) (摘要) 在 单 因素试 验的基 础上 ，采 用响应 面法试 验 ，优 化 了胞 外 多糖硫 酸 酯化 的工 艺条 件． 结果表 明 ，优化 的硫酸酯化条件 为氯磺酸 与吡啶摩 尔 比 1：3．85，反应 温度 73℃，反应 时间 3．34h．在 此条件 下 ，硫 酸基 团取 代度 为 1．02． (关键 词] 茯苓 菌丝体 ；胞 外 多糖 ；硫 酸 酯化 ；响应 面 [文章 编号] 1672—2027(2013)01-0130—04 [中图分 类号] Q539 (文 献标识 码] A 茯苓是我国传统的中药材，具有渗湿、利尿、健脾等功效．茯苓多糖因具有调节机体免疫，抑制肿瘤生长 等功能，而成为近年来研究较多的真菌多糖． 为提高多糖的生物学活性，将天然多糖进行硫酸酯化结构修饰已成为多糖研究的热点之一．众多研究发 现 ，硫酸酯化多糖具有抗肿瘤 、抗病毒、抗凝血 、增强机体免疫功能等多种生物学活性口 ]． 本实验室通过液体深层发酵培养茯苓，获得茯苓发酵液，经检测，发酵液中含有大量茯苓菌丝体胞外多 糖．目前 ，关于茯苓菌丝体胞外多糖硫酸酯化的研究报道较少 ，本文通过响应面试验研究了茯苓菌丝体胞外 多糖硫酸酯化的工艺条件 ，为今后该多糖的生物学活性研究提供 了实验依据． 1 材料与方法 1．1 供实验用样品 通过 1OL发酵罐进行液体深层发酵培养获得茯苓发酵液，经检测，发酵液中含有大量菌丝体胞外多糖． 经提取纯化 ，得茯苓菌丝体胞外多糖。 1．2 主要仪器设备 752N紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，TGL20M—II高速冷冻离心机(湖南凯达科学 仪器有限公司)． 1．3 茯苓菌丝体胞外多糖硫酸酯化条件的优化 采用氯磺酸一吡啶法制备茯苓菌丝体胞外多糖硫酸酯衍生物．在冰浴及搅拌的条件下逐滴将氯磺酸缓 慢滴人吡啶中，配制成硫酸酯化试剂． 称取 1g多糖溶于 20mL甲酰胺 ，然后加入硫酸酯化试剂．反应液水浴加热至一定温度 ，并持续搅拌反 应一定时间．反应停止后冷却至室温 ，加入预冷的蒸馏水 中，氢氧化钠 中和至中性 ，后加人 3倍体积无水乙 醇 ，析出沉淀．6000r／min离心 10min，收集沉淀 ，得茯苓菌丝体胞外多糖硫酸酯衍生物． 以硫酸基团取代度为检测指标，考察氯磺酸与吡啶摩尔 比、反应温度和反应时间对多糖硫酸酯化效果的 影响．通过单因素试验找出试验因素水平范围，经响应面试验确定最佳多糖硫酸酯化条件． 1．3．1 氯磺酸与吡啶摩尔 比优化试验 将氯磺酸与吡啶以不同的摩尔比配制成硫酸酯化试剂 ，按 1．3所述进行多糖硫酸酯化 ，其 中，反应液水 浴加热温度为 7O℃，持续搅拌反应 3h． 1．3．2 反应温度优化试验 按 1．3所述进行多糖硫酸酯化，其 中，分别调节反应液水浴加热温度为 50℃，60℃，7O℃，8O℃， 收稿 日期 ：2012—09—28 作者简介 ：韩 勇(1978一)，男，山西太原人，硕士，山西药科职业学院助教，主要从事发酵工程研究 第 1期 韩 勇：茯苓菌丝体胞外多糖硫酸酯化工艺的研究 131 90℃，100℃，持续搅拌反应 3h． 1．3．3 反应时间优化试验 按 1．3所述进行多糖硫酸酯化 ，分别持续搅拌反应 1h，2h，3h，4h，5h． 1_3．4 响应面试验 在单因素试验的基础上，采用 Box-Behnken试验设计对多糖硫酸酯化条件进一步优化，运用响应面分 析确定影响因素的最佳条件． 1．4 硫酸基团取代度检测 采用硫酸钡浊度法测定硫酸基团含量 (S )，硫酸基 团取代度 (degreeofsubstitution，Ds)按公式 ：Ds— 1．62×S ／(32一1．O2×S )计算[4]． 2 结果与分析