甘蓝类蔬菜的细质dna多样性研究.pdfVIP

摘要 oleracea 甘蓝类蔬菜(BrassicaL．)属于十字花科芸薹属，包含结球甘蓝、青花菜、花 椰菜、球茎甘蓝、芥蓝、羽衣甘蓝、抱子甘蓝等七个栽培变种。2006年全国结球甘蓝(Brassica oleracea vat．capitataL)的种植面积达93．73万公顷。结球甘蓝杂交种的生产主要利用自交 不亲和系和雄性不育系两种途径，其中雄性不育系包括显性核基因雄性不育(DGMS)和改 良的Ogura萝卜胞质不育(CMS)。但雄性不育系的利用存在胞质单一的风险。从分子水平 研究甘蓝变种间和变种内的细胞质DNA多态性，为显性雄性不育系和胞质不育系的胞质多 样化提供科学依据，而且对于阐明甘蓝各变种的进化路线具有重要意义。 本研究利用甘蓝类蔬菜不同变种间和变种内材料，以开发的叶绿体SSR(cpSSR)和线 粒体SSR(mtSSR)引物进行多态性筛选；利用全基因组重测序结果，全面揭示六份结球甘 蓝材料间的细胞质DNA多样性；以获得的特异SNP或CAPS标记进行OguraCMS不育系 或DGMS不育系胞质多样性的验证。研究结果如下： 1．利用已公布的拟南芥叶绿体、油菜线粒体全基因组序列，首次开发出可在结球甘蓝 线粒体基因组SSRs(mtSSRs)，SSR出现频率分别为1．736kb／1个SSR、7．650kb／1个SSR。 C322和波里马油菜N478、N479间有扩增产物多态性，这些多态性片段均位于基因内含子 区或基因间隔区。多态性片段测序结果显示单核苷酸A／T重复数从8个到13个不等，相似 守程度比叶绿体要高。这些细胞质SSR引物在结球甘蓝上的成功应用，为甘蓝类蔬菜细胞 质多样性研究提供了基础。 2．利用开发的cpSSR引物进行甘蓝类蔬菜不同变种间细胞质DNA多态性筛选，首次 获得了具有变种特异性的叶绿体单核苷酸多态性(sNP)标记，并成功将其转化为dCAPS 标记。以32对在结球甘蓝上应用的cpSSR引物对结球甘蓝、青花菜、花椰菜、芥蓝、球茎 甘蓝等5个不同变种进行标记筛选，在聚丙烯酰胺凝胶电泳上没有获得扩增产物长度多态 性。对这32对引物的PCR扩增产物进行测序，利用DNAstar软件比对发现1个SNP位点， 该位点初步呈现变种特异性。为简便快速鉴定该SNP位点，将其成功转化为衍生的酶切扩 Rsa 增多态性序列(dcAPS)标记一ACP43．93I。以该dCAPS标记对甘蓝类蔬菜不同变种 的206份材料进行筛选，进一步验证了该标记的变种特异性。全部花椰菜和大部分青花菜为 同一单元型，其它甘蓝变种为另一单元型，由此推测青花菜和花椰菜的分化时间相对较晚。 同时，利用三个甘蓝变种的雄性不育回交群体明确了该叶绿体SNP为母性遗传标记。 3．采用Solexa基因组重测序方法，以结球甘蓝02．12新组装的叶绿体和线粒体基因组 CMS 全长序列为参考，全面揭示六份结球甘蓝材料(OguraR1、R2、R3、自交系60Ti锄、 CMS 胞质雄性不育材料OguraRl、R2、R3在叶绿体基因组水平上的SNP个数分别为1010、 CMS 量在OguraR1、R2、R3中呈现逐步减少的趋势，表明异源胞质含量越少，胞质不育系 CMS 的应用前景就好。与结球甘蓝自交系Bo-1相比，OguraR3特有的9个叶绿体SNPs、 一步改良提供有效的筛选标记。在三份结球甘蓝材料Bo-1、Bo．7、Bo．8中，各自特有的叶 个数分别为0、3、0，表明结球甘蓝变种内材料间具有细胞质多样性，为DGMS不育系的 胞质多样化提供依据。 CMS 不育源CMS R3、CMSHY进行分子鉴别，发现了在可实用Ogura胞质不育源中的胞质多样 性。在cpSSR水平上，无法在聚丙烯酰胺凝胶电泳上获得多态性，经测序仅发现两种不育 烯酰胺凝胶电泳上区分这两种不育源，经测序发现其余5对mtSSR引物的扩增产物上存在 9个多态性差异，其中3个为SSR位点重复数的变异。将其中2个可被MseI酶切的多态性