大白菜dreb转录因子cdna的克隆及植物表达载体的构建.pdfVIP

摘 要 干旱、盐碱、低温等非生物逆境胁迫对植物的生长发育有重要影响，是农作 物减产的直接原因。提高植物的抗逆性可以减轻胁迫伤害、提高产量、节约淡水 资源，对农业增产、生态环境改良、实现可持续发展具有重要意义。DREB 转录 因子能特异性地与 DRE 元件（脱水应答元件）结合，激活许多逆境诱导基因的 表达,它在植物对干旱、高盐及低温胁迫的分子反应中起着重要的调控作用。逆 境胁迫下 DREB 转录因子能够调节功能基因的表达，普遍提高植物对逆境的抵 抗和忍耐能力，因而能够综合改良植物的抗逆性状，是迄今为止最理想的植物抗 逆工程基因。 本研究以逆境处理的大白菜为试验材料，运用 RT-PCR 技术，克隆大白菜 DREB 转录因子基因 cDNA 序列，对逆境胁迫下的基因诱导表达模式进行了研 究，并成功构建了植物表达载体，结果如下： 1. 根据已发表的甘蓝型油菜 DREB 转录因子基因序列设计引物 DR2-1 和 DR2-2 ，进行RT-PCR 扩增，得到两个长 645bp 编码 214 个氨基酸的基因，分别 命名为 BcDREB1 （GenBank 登录号为：EU924266 ）和BcDREB2 （GenBank 登录 号为：GQ122331 ）。同源性分析表明，两个基因与甘蓝型油菜 DREB2-2 基因、 芥菜 DREB1B 基因的氨基酸序列同源性均在 90% 以上。 2. 利用 SMART 和 Protparam 分析表明，BcDREB1 推断的氨基酸相对分子 量为 23.90KD 、等电点为4.88 ；BcDREB2 推断的氨基酸相对分子量为 23.85KD ， 等电点 5.21，它们都包含一个典型的AP2 结构域。 3. 半定量 RT-PCR 分析表明，低温、干旱、高盐均能诱导大白菜 DREB 基 因表达。在低温胁迫时 1h 开始表达，3h 到达最高；在高盐胁迫时 1h 开始表达， 12h 到达最高；在干旱胁迫时 3h 开始表达，12h 到达最高。 4. 设计含有Xba I 和 BamHI 酶切位点的正义特异性引物 DR-F 和 DR-R ，用 BamHI 和 Xba I 分别酶切含有 BcDREB1 基因的质粒和 pCAMBIA2301 载体，用 T4 DNA Ligase 连接，构建成大白菜 BcDREB1 基因的正义植物表达载体 pCAM-BcDREB1 。 5. 设计含有 BamHI 和Xba I 酶切位点的反义特异性引物 DR1-F 和 DR1-R ， 用 BamHI 和 Xba I 分别酶切含有 BcDREB1 、BcDREB2 基因的质粒和 pCAMBIA2301 载体，分别用 T4 DNA Ligase 连接，构建成大白菜 BcDREB1 、 BcDREB2 基因的反义植物表达载体 anti-pCAM-BcDREB1 和 anti-pCAM- BcDREB2 。 6. 利用冻融法将植物表达载体 pCAM-BcDREB1 、anti-pCAM-BcDREB1 和 anti-pCAM-BcDREB2 转化到农杆菌 EHA105 中，经特异性引物对转化菌液进行 PCR 扩增，证实表达载体已转入农杆菌。 关键词: 大白菜；DREB 转录因子；基因克隆；植物表达载体；基因表达模式 Cloning of DREB-like Transcription Factor cDNA in Chinese Cabbage and Construction of Plant Expression Vector Author: Li Yan Major: Olericulture Tutor: Shen Shu-xing Wang Ya