红肉脐橙(cirus sinensis [l.]osbeck)番茄红素β-环化酶基因(lcyb)功能的初步验证和分析.pdfVIP

红肉脐橙(Citrus 基因(Lcyb)功能的初步验证和分析 摘要 红肉脐橙(Citrus sinensis【L．】Osbeck)是华盛顿脐(Citrus 的红肉突变体，是果肉呈粉红的脐橙品种，其果肉中主要含有番茄红素和∥．胡萝卜 素，是研究柑橘果实类胡萝卜素代谢的良好素材。番茄红素伊环化酶(LCYB)在 柑橘类胡萝卜素合成代谢途径中起关键作用，该酶能使反式番茄红素转化为伊胡萝 卜素，是番茄红素向下游代谢物质转化的一个关键分支点。 目前，本课题组已经从红肉脐橙中克隆到番茄红素伊环化酶基因(Lcyb)，为 了对该基因的功能进行鉴定分析，本研究以红肉脐橙中克隆到的番茄红素伊环化酶 基因(Lcyb)两个转录本的cDNA为目的片段，通过农杆菌介导的转基因手段，以 esculentum Mill．)为受体材料进行了遗传转化，通过抗性筛选， 番茄(Lycopersicon 获得转基因植株群体，通过对转基因植株群体及其后代进行分子水平的检测和生理 指标测定分析，表明红肉脐橙中克隆到的番茄红素伊环化酶基因(Lcyb)及其产物 具有正常功能。主要结果如下： 1．利用已构建成功的含有红肉脐橙番茄红素伊环化酶基因(Lcyb)cDNA片段的 载体，通过农杆菌介导的遗传转化方法将它们成功导入番茄品种中蔬5号中。获得 卡那霉素抗性植株14棵，提取部分To代转化番茄PCR阳性植株的基因组DNA， 1．3个不等。 2．To代转化番茄中有两棵植株的果实在成熟时果实色泽表现出明显的改变，成 熟果实呈黄色，对照的非转化植株成熟果实则为红色。对T0代番茄果实进行了色 差值的测定，发现多数转基因果实相对于对照偏黄。通过HPLC(高效液相色谱)测 定黄色转基因果实的色素成分和比例发现，其伊胡萝卜素的含量极显著的高于对 照，而番茄红素的含量则显著低于对照。说明转基因植株中，外源伊环化酶基因 (三啪)确实超量表达，致使番茄红素大量向伊胡萝卜素转化，导致果实积累伊胡萝 卜素而呈现出黄色。 相对表达量，14株转基因植株中有8株检测到目的基因的表达，表达量各有高低。 通过Real—timePCR检测转基因植株果实中其他色素代谢相关基因的表达情况，发现 在色素代谢途径中，位于Lcyb基因上游的基因在转基因植株中的表达量普遍降低， 而位于rcyb基因下游的基因在转基因植株中的表达量上升。 增分析鉴定，发现单拷贝的植株NPTII基因分离符合1：3的比例。 关键词：柑橘；类胡萝卜素；番茄红素伊环化酶；基因表达；遗传转化 2 FunctionalVerificationofthe Gene(Lcyb) Lycopenebeta—cyclase from‘CaraCara’navel sinensis【L．】Osbeck) orange(Citrus Abstract abud ‘CaraCara’navel cultivar,is orange(Citrussinensis[L．】Osbeck)red—fleshed of‘CaraCara’navel orange．Themajor intheflesh of‘Washington’navel pigments sport and isusefulfortheresearchofthecarotenoid are beta-carotene．It orangelycopene