魔芋hogs抗毒特性及作用机理研究.pdfVIP

摘 要 随着人们对健康的日益关注，安全、有效、特异的抗病毒生化药物研究成为热 点。多糖作为生物活性物质能够提高机体免疫力，并具有低毒和低耐药性等特点， 其中，硫酸化多糖又不同于一般多糖的免疫调节机制，而是通过其硫酸聚阴离子对 病毒感染细胞进行抑制作用发挥更强的抗病毒活性，显示了广阔的抗病毒药物开发 前景。为此，本论文以我国西部丰富的特产资源魔芋葡甘聚糖(Eonjac Oligo．konjac 析对制备得到的魔芋葡甘低聚糖醛酸丙酯硫酸酯(Hydroxylpropyl Glucomannannuroate Sulfate，HOGS)分离纯化，并运用葡聚糖凝胶层析、醋酸纤维素薄 膜电泳及高效液相色谱鉴定其纯度。采用气相色谱(GC)、凝胶渗透色谱(GPC)、傅 核磁共振波谱(1H—NMR)等现代分析手段和技术，对其进行了结构表征。通过MTT 细胞毒性，确定其最大无毒浓度。按直接抑制病毒包膜蛋白、抑制病毒在胞内复制 和表达、抑制病毒吸附细胞和阻断病毒受体(保护细胞不受病毒侵染)四种不同作 用方式分组进行抗病毒特性研究。通过细胞病变(CPE)观察、MTT法测定细胞存活 率等方法确定HOGS抗柯萨奇3型病毒、脊髓灰质炎I型病毒的作用特性；通过ELASA 毒DNA含量等方法研究HOGS抑制乙肝病毒抗原表达和DNA复制的过程；通过血凝活 性、病毒表面神经氨酸酶活性测定及荧光RT—PCR法检测病毒RNA含量等方法研究 HOGS抗甲型流感病毒血凝效价，直接抑制病毒进入细胞后释放、扩散和在胞内复制 过程的作用机理。 研究的主要结果如下： (1)二次硫酸化制备的HOGS经过乙醇二次沉淀后采用离子交换树脂将硫酸化 与未硫酸化的样品分离纯化，结果显示，离子交换洗脱曲线出现的糖峰为单一峰， 表明硫酸化HOGS组分均一，达到了分离纯化的目的。葡聚糖凝胶层析纯度鉴定结果 显示，洗脱曲线出现的糖峰为单一对称峰，可以判断HOGS为分子大小和形状均一的 组分；醋酸纤维膜电泳结果为一条单一谱带，样品已达到电泳纯，表明样品是单一 组分；高效液相色谱图结果显示，经过离子交换纯化的HOGS得到单一样品峰，表明 其杂质含量较低，面积归一化法计算纯度为96．39+0．52％。分离纯化及纯度鉴定表 明HOGS已达到较高纯度，为后续研究奠定基础。 (2)硫酸化多糖的结构显著影响其抗病毒活性。气相色谱法分析HOGS的魔芋 葡甘低聚糖部分由甘露糖、葡萄糖聚合而成，其摩尔比约为：Man：Glu=1．8：1。凝 胶渗透色谱分子量分布测定结果显示，色谱图呈正态分布，多分散系数Mw／mn=1．01， n为3．62×104，制得的HOGS 分子质量Mn为1572D，相对分子质量分布宽度指数0 纯品为一种相对分子质量分布很窄的硫酸化多糖。FT—IR和RAMAN结果显示，由于 硫酸基团特征吸收峰的出现，分子已接上硫酸基团。XPS分析显示，HOGS已引入硫 元素，纯化HOGS的S元素的相对含量质量分数为58．79％，其S元素含量与未纯化 HOGS相比，提高约40％，同时，对S2P进行曲线拟合，根据结合能数据分析，对于S 原子仅可能以一oso；形式存在。1H_NMR分析显示，糖环的C：和C。位在硫酸化修饰后， 化学位移发生漂移变化，提示硫酸基可能连接在C：和C。位，而且甲基氢的化学位移 发生改变，表明在C6位连接的羟丙基上的羟基可能接有硫酸基团。 24h，再加入CVB。，能够显著减轻细胞病变程度，减少病变细胞数量，对CVB。侵染细 胞起到一定的阻断作用，保护了Hela细胞不受病毒的感染，且随着HOGS浓度的增 加，其保护细胞作用增强。 根据细胞存活率计算半数抑制浓度IC∞及抑制指数TI，阻断病毒侵染组(4h)： TI值为4．40。直接抑制病毒组(1h)：IC∞为0．2338mg／mU，TI值为2．86；直接抑 抗CVB。的抑制指数TI较高，抑制效果较好。初步推断可能是HOGS竞争结合了细胞 表面的柯萨奇病毒受体所致。 (4)HOGS抑制PV。病毒胞内复制作用研究结果表明，PV。病毒先感染细胞，作 用2h后，再加入HOGS，对细胞病变的程度和数量均有明显的抑制作用，即使在较 低的浓度下，细胞病变也能受到有效抑制，说明HOGS抑制PV，的主要作用特性是在 Pv。进入细胞后，对其RNA在胞内的释放和生物合成过程的抑制作用。