【基因工程】第二章基因工程的基本操作程序..pptVIP

tk- 细胞突变株筛选转染细胞 胸苷激酶（tk） TTP：从头合成（氨甲喋呤阻断），补救合成 HAT选择（H：次黄嘌呤；A：氨甲喋呤；T：胸苷） tk+：生长 tk-+带tk基因的质粒：生长 药物筛选转染细胞 neor 新霉素：细菌抗生素，干扰原核生物蛋白质合成 G418：干扰原核、真核生物 neo：磷酸转移酶，使G418失活 neo 与目的基因连锁,转染 作业： 1．? 如何获得目的基因片段？ 2．? 简述基因工程的基本操作程序 3. 与原核细胞表达系统相比较, 真核细胞表达系统的特点是什么? 化学合成法的基本方法 全基因合成 混合退火 （2）补钉延长法： 根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体 Klenow酶聚合 化学合成法的基本方法 全基因合成 （3）大片段酶促法： 混合退火 根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体 Klenow酶聚合 化学合成法的基本方法 全基因合成 上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7% 生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针 探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间 探针内部不应出现可能的互补区域 化学合成法的基本方法 探针等寡聚核苷酸合成 在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其编码的DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNA法得到的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子。 由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时必须考虑下列问题: 化学合成法的基本方法 探针等寡聚核苷酸合成 某段连续的氨基酸序列 Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile 所有可能的DNA序列 TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T GATG G G T T C CGA CGG CGT CGC 设计的简并探针序列 TGTATGGACGAIATGA TGTATGGATGAIATGA TGCATGGACGAIATGA TGCATGGATGAIATGA A G 此外还可以参考各种生物体的EST数据库进行倾向性简并序列设计 expressed sequence tag 化学合成的单元操作 化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。 从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的 化学合成的单元操作 O H G H H H H O CH 2 O DMT P O Me N CH Me Me CH Me Me H DMT： 二甲氧基三苯甲基 激活 缩合 氧化 脱取代基 玻璃珠 连接臂 DNA化学合成的用途 合成天然基因 修饰改造基因 设计新型基因 制备探针、引物、接头 如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等 如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等 二．DNA片段与载体DNA体外重组 外原基因（DNA片段）很难直接透过受体细胞的细胞膜进入受体细胞，即使进入，也会受到限制性内切酶的作用而分解。 要将外源基因导入受体细胞，必须选择适当的载体。 作为载体的DNA分子所具备的条件： 1、容易进入寄主细胞 2、进入寄主细胞后能够独立进行自主的复制和表达。 3、容易从宿主细胞中分离纯化 常用的载体：质粒、噬菌体、病毒和粘粒 载体是外源基因进入受体细胞的工具。 DNA重组技术 核心步骤：DNA片段的体外连接 本质：涉及限制酶，连接酶等酶促反应过程 载体：质粒和温和噬菌体 需两大酶： DNA限制性内切酶和DNA连接酶 此外：DNA聚合酶、逆转录酶、DNA修饰酶、RNA修饰酶、核