一植物病原真菌的分离培养及纯化技术.创新.pptVIP

* * * * 各种真菌病害发生的部位和症状不同，其分离要根据具体情况，采用不同的方法，下面介绍几种典型材料的分离法。 4.1.1 斑点病病原真菌的分离 4.1.2 维管束组织内病原真菌的分离 4.1.3 根腐病菌的分离 4.1.4 肉质组织中病菌的分离 4.1.5 种子内病菌的分离法 * 4.1.1 斑点病病原真菌的分离 从病斑切取每边约3-5mm的小块病组织，用70%的酒精浸几秒钟，再在0.1%的酸性升汞水溶液中浸3-5分钟；而后用灭菌水换洗3次，将其移置在琼脂培养基平板上培养。 * 4.1.2 维管束组织内病原真菌的分离 * 从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后，用灭菌水冲洗几次，移置培养基面上。 * 4.1.3 根腐病菌的分离 根腐或基腐病菌的分离，由材料的大小决定。 材料小的可以仿照斑点病的分离法。 材料大的则可采用维管束组织内病原真菌的分离法。 * 4.1.4 肉质组织中病菌的分离 多肉的茎、根和果实等，可以采用维管束组织内病菌的分离法，除去表面组织，切到其中小块病组织分离。 如有杂菌感染可采用“直接接种”法，待出现症状后，用此法再行分离。 * * 种子如在未破裂的果荚内，可以不经过表面消毒，在无菌的条件下取出移在培养基平板上培养。 4.1.5 种子内病菌的分离法 将整粒的种子或种子的一部分进行表面消毒（升汞或漂白粉），用灭菌水洗涤后移在琼脂培养基平板上培养。 * 稀释法是微生物学上最早使用的分离法，主要用于分离细菌和酵母菌等。 4.2 稀释分离法 植物病原真菌的分离一般很少用稀释法分离，但有些产生大量孢子的病原真菌和霉菌，可以配成孢子悬浮液稀释分离。 * 方法： 用无菌水从发病组织表面冲下孢子，配成孢子悬浮液， 用无菌移液管或滴管吸取一定体积的菌液至平板培养基上， 然后用无菌玻璃棒将菌液轻轻的均匀涂布在整个平板上，或将菌液移至无菌培养皿中，然后倾入融化后冷却至45℃的培养基， 轻轻振荡、平置、凝固后倒置培养。 * 4.2.1 孢子分离法 产生大量孢子的病菌如青霉属(Penicillium)、交链孢属(Alternaria)、小丛壳属(Glomerella)、拟茎点霉属(Phomopsis)及茎点属(Phoma)等，则可配制成孢子悬浮液,以稀释法或划线法分离。 * 许多真菌的孢子在成熟时有弹射的作用，这样就可以将产生孢子的材料，放在琼脂培养基平板的下面或者悬挂在上面，便孢子弹射在培养基上而得到纯培养。 * 典型的是担子菌亚门大型真菌担孢子的分离和获得： 担孢子无色或有色，浅色的担孢子需要成团堆积时方能辨识，一般是依靠“孢子印”。 * 为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。 分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。 4.2.2 土壤带菌分离法? * 稀释倒平板法示意图 * 稀释涂布法示意图 * 1.dilute sample 1 ml 9 ml 10 100 1000 104 105 106 107 2. plate out 0.1 ml 平板稀释法 * 图 平板划线分离法 1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法 * 平板划线方法示意图 * 分离真菌时经常有细菌污染。将培养基调节至酸性反应，如在10ml培养基中加1-2滴25%的乳酸，可使大部分细菌受到抑制，而并不影响真菌的生长。 4.3 细菌污染的排除 * 培养基中加适当的抗菌素是抑制细菌生长很有效的方法。 加金霉素(30ug/ml)可抑制多数细菌的生长， 加青霉素(20ug/ml)可抑制革兰氏阳性细菌的生长， 加多粘霉素B(5.0ug/ml)可抑制G—阴性细菌的生长， 加链霉素(40ug/ml)或氯霉素(50ug/ml)可以抑制大部分细菌的生长。 除去氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在培养基灭菌后并冷却到45℃左右时加入(以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)。 * 5、内生真菌的分离 先将健康组织，如：叶片和茎，用自来水冲洗干净、晾干水分后, 剪成约1.5cm×1.5cm的小片(叶)或1.5cm长的小段(茎)。按下列程序进行表面消毒: 70%酒精漂洗30s→0.1%升汞漂洗1min →70%酒精漂洗30s→无菌水冲洗4次，在无菌滤纸上吸干水分。 将上述处理过的材料在无菌状态下剪切成0.5cm×0.5cm 小片（剪去0.5cm的边缘），或0.3~0.