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操作步骤(一) 研钵处理:0.4N NaOH 浸泡过夜,DEPC水洗涤3遍; 液氮磨样,每管分装0.1克样品; 每管加1毫升Trizol 试剂(样品体积不超过Trizol 试剂体积的10%),迅速混匀(若样品较多可先将混好的样品置于冰上);室温下净置5-10分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离; 加200 μl的氯仿,用手剧烈摇荡15秒,室温下静置5分钟左右; 2-8 ℃ ,12000×g 离心10-15分钟; 将水相(上清)转入一新离心管,加0.5ml 异丙醇室温下沉淀10分钟; 2-8 ℃ ,12000×g 离心15分钟; 弃上清,加1ml 75%乙醇清洗RNA,振荡片刻后(务必使沉淀悬浮起来,以确保洗涤干净),7500×g 离心5分钟,小心弃上清; 室温静置5-15分,使RNA沉淀恰好干燥,加入20 μl DEPC水溶解,保存于-70 ℃ 。 取2 μl 琼脂糖电泳检测RNA质量。 操作步骤(二) What are Total RNA like? Specific, Good, Contamination, Degradation Callus Leafs Degradation Contaminant RNA产量低的原因 样品研磨不彻底,没有混匀,裂解不彻底 RNA没有完全溶解 RNA降解的主要原因 取样后没有立即抽提RNA; 抽提过程中超作不当,样品量超过了许可的范围; 样品运输、保藏不当,或RNA保藏不当,应放入-70 ℃ ,而不是-20 ℃ ) 使用的溶液或器皿有RNase污染 琼脂糖变性胶(甲醛)电泳时pH值低于3.5 DNA污染的原因 样品太多,所加试剂相对太少 用来分离RNA的样品中含有机溶剂(乙醇,DMSO等),或碱溶液等 实验八 RT-PCR (Reverse transcription PCR) 实验目的:学习RT-PCR的原理及其操作过程 实验材料:水稻幼嫩叶片RNA 实验原理: 目前PCR技术只能扩增DNA模板,对RNA模板不能直接扩增。mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增,这种在mRNA反转录后进行的PCR扩增称为RT-PCR。RT-PCR比Northern杂交更灵敏,对RNA的质量要求较低,操作简便,它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。 本实验以水稻叶片RNA为材料,检测β-actin基因的表达。实验中设定2个阴性对照:一个不加模板RNA,另一个不加反转录酶,主要是消除DNA及PCR试剂方面引起的假阳性;同时以叶片DNA为阳性对照,检验PCR试剂和扩增过程是否有问题 操作步骤(一) RNA Preparation Prepare the plant total RNA by TRIzol Reagent. Dilute the Total RNA to the final concentration of 1 ?g / ?l by DU640. . Combine the following in a 0.5 ml sterile eppendorf tube: Total RNA 0.5-1?g RNase-free DNase ? 1?l (1u / ?l) 10× DNase ? buffer 1 ?l DEPC-treated ddH2O 5 ?l Incubate at 37℃ for 15 min, then 70℃ for 10 min. 操作步骤(二)Reverse Transcriptase Reaction Add 1 ?l 500 ?g / ml oligo (dT) 15 primer, mix the contents of the tube by gently vortexing and collect the reaction by brief centrifugation. Heat the mixture at 65℃ dry bath for 10 minutes, then place at room temperature for 10 minutes. Add the following contents: 5 × first strand buffer 4 ?l 0.1 M DTT 2 ?l 10 ?M dNTP 1 ? 操作步骤(二) Mix the contents of the tube by gently vortexing and collect the reaction by brief centrifugation. Place the tube at 37℃ w
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