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人B7．H4基因转染细胞株的构建与鼠抗人B7．X4单克隆抗体的制备 中文摘要 中文摘要 B7．H4分子是近年发现的一个新的协同刺激分子，其基因定位于lpll．1，编码 巴组织和非淋巴组织。新鲜分离的外周血T、B淋巴细胞、单核细胞及树突状细胞 均无B7．H4的表达，但体外刺激后，均可被诱导表达。近来的研究表明，B7．H4 分子属于负性调节分子，它可以抑制T细胞的增殖，细胞因子的分泌以及细胞周 期的进行，从而下调T细胞的免疫功能。虽然B7．H4蛋白在大多数正常组织中几 乎不表达，但其在一些肿瘤细胞上的过表达，说明B7．H4分子在帮助肿瘤细胞逃 避免疫监视过程中起到重要作用，另外B7．H4在维持机体免疫耐受过程中也起到 重要的作用。因此，该分子成为免疫学研究的热点之一。 本研究旨在通过克隆人B7．H4基因，并建立人B7．H4基因转染细胞株，研制 特异性鼠抗人B7．H4单克隆抗体，并对其生物学功能进行初步的研究。 一、人B7．H4基因转染细胞株的构建及其生物学功能的初步研究 人B7．H4转基因细胞株并初步研究其生物学功能。 【方法】通过RT-PCR的方法获得人B7一H4分子的全长基因，设计特异性引物， I和BamH 通过PCR方法获得目的片段，将目的片段双酶切(EeoR I)后与 行鉴定；脂质体转染法将重组载体导入L929细胞，经G418))n压筛选并通过流式细 CD69的表达及T细胞增殖实验对B7．H4转基因细胞的生物学功能进行初步研究。 【结果】构建了一株稳定高表达人B7-H4分子的转基因细胞株，对其生物学功 的活化增殖起到抑制作用。 【结论】成功构建一株稳定表达B7．H4分子的基因转染细胞株，为进一步研制 B7．H4分子的单克隆抗体提供了有效的免疫原。 中文摘要 人B7．H4基因转染细胞株的构建与鼠抗人B7-H4单克隆抗体的制备 二、B7．H4单克隆抗体的制备及其生物学特性的研究 【目的】研制鼠抗人B7．H4分子的单克隆抗体(mAb)并鉴定其生物学特性 【方法】以高表达人B7．H4分子的转基因细胞L929／B7。H4为免疫原，常规免疫 BALB／cd、鼠，采用B淋巴瘤杂交技术，经免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复 筛选、多次克隆化培养，获得两株可特异分泌鼠抗入B7．H4分子单克隆抗体的杂交 blot鉴定单抗的特异性，竞争结合抑制实验鉴定单抗所识别的抗原结合位点，T细 胞增殖抑制阻断实验对单克隆抗体的生物学功能进行初步的鉴定。 【结果】获得两株持续、稳定地分泌抗B7．H4单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别 Western 别。位点竞争实验表明，两株单抗之间，单抗1F10与商品化的抗体H74之间识别 位点均不同，单抗282与商品化抗体识别位点相近。T细胞增殖抑制阻断实验显示， 这两株单抗均能一定程度地阻断B7．H4对T细胞增殖的抑制作用。 【结论】成功地获得两株鼠抗人B7．H4分子的单克隆抗体，为进一步研究B7一H4 分子的生物学功能提供了有效的工具。 综上所述，本研究成功构建了基因转染细胞株L929／B7．H4，并以此为免疫原 成功获得两株能稳定分泌鼠抗人B7．H4单克隆抗体的杂交瘤细胞株。T细胞体外 在一定程度上阻断这种抑制效应，为进一步研究B7．H4分子生物学功能奠定了物 质基础。 关键词：协同刺激分子；B7一H4；基因转染细胞；单克隆抗体；T细胞 作 者：徐慧 指导教N-顾宗江教授 张学光教授 人B7一H4基因转染细胞株的构建与鼠抗人B7．H4单克隆抗体的制备 英文摘要 ofHumanB7．．H4 Construction TransfectedCells and