异源四倍体鲫鲤BAC文库的构建和其功能基因的遗传变异分析.pdf

中文摘要 IIIIIIIIIIIIIIHIlUlIIIIIIIIII auratus 异源四倍体鲫鲤来源于红鲫(carassius redvar．，早，2n L．，8，2n-100)的人工远缘杂交。在 =100)×鲤鱼(cyprinuscarpio 杂交子代的F1和F2群体中，杂种子代为可育的二倍体，自F3开始 出现异源四倍体杂交子代，并且该异源四倍体鲫鲤群体两性可育， 代代相传，目前已经过多代的人工选育(F3．F23)，遗传性状稳定， 遗传谱系清晰。异源四倍体鲫鲤是通过远缘杂交产生的世界上首例 的异源四倍体鱼类，在生产实践以及科学理论研究中都发挥着重要 的作用。在生产实践方面，利用雄性四倍体鲫鲤与雌性二倍体红鲫 交配产生了用于大规模养殖的不育三倍体湘云鲫2号，产生了巨大 的经济效益，同时带动了鱼类杂交遗传育种的进展；而在理论科学 研究方面，异源四倍体鲫鲤作为红鲫和鲤鱼的杂交子代，继承了双 亲的遗传物质，其染色体数目已从双亲的100条变为200条染色 体，另外其在遗传学、细胞学以及进化生物学等方面都产生了一定 的遗传变异，已具备了形成一个新物种的前提条件。研究异源四倍 体鲫鲤的基因组特征对于分析脊椎动物远缘杂交的遗传机制，远缘 杂交过程中杂种的基因组变异，以及杂种的进化命运等生物学现象 具有重要的意义。 本论文在构建异源四倍体鲫鲤BAC文库的基础上，通过进行 14个克隆的全长测序初步分析了异源四倍体鲫鲤的基因组特征(包 括GC含量、重复片段Ll,ffd等)，另外通过比较基因组学研究分析 了异源四倍体鲫鲤内含子进化的特征，除此之外，本论文通过长 PCR技术扩增了红鲫、鲤鱼和四倍体鲫鲤7个同源基因的部分基因 序列并从内含子，外显子和整体基因序列的水平进行了比较分析。 1．异源四倍体鲫鲤BAC文库的构建 本论文初步构建了异源四倍体鲫鲤的BAC文库，该BAC文库 共包含阳性克隆31，023个，经NotI酶切检测后克隆的平均片段大小 构建的BAC文库与其他物种所构建的BAC文库相比插入片段较 小，整体覆盖度较低，这可能与四倍体鲫鲤复杂的基因组结构有关 (含有双亲两套基因组)。本实验所构建的异源四倍体鲫鲤的BAC 文库虽然并不完善，然而其在目前并无四倍体鲫鲤全基因组数据的 情况下将对异源四倍体鲫鲤的研究起到至关重要的作用，为后期异 源四倍体鲫鲤的全基因组测序奠定了基础，同时也为异源四倍体鲫 鲤的功能基因组学以及与亲本红鲫和鲤鱼的比较基因组学研究提供 了宝贵的资源。 2．BAC克隆全长的测序及分析 为了初步观察和探讨异源四倍体鲫鲤的基因组序列特征以及评 估其基因组中重复序列的比例，本实验对14个随机挑选的BAC克 隆进行了鸟枪法的全长测序，14个BAC克隆的序列长度在 例比其父本鲤鱼的GC含量(36．8％)稍高，究其原因可能与异源四 倍体鲫鲤高水平的甲基化程度相关。总之，14个BAC全长序列共 T1 产生了591，126bp的碱基序列共涵盖了0．02％的异源四倍体鲫鲤的基 行了重复序列的分析，14个BAC克隆的全长序列经分析共产生了 103，41 lbp(17．46％)的重复序列。异源四倍体鲫鲤中最丰富的重复 (2．72％)， 元件是反转座子(6．47％)，包括长散布元件(LINE) 长末端重复序列(LTR)(3．66％)；接着是DNA转座子 (4．17％)；另外，预测出105个小RNA重复序列。而在其父本鲤 鱼中，DNA转座子的比例为6．67％，而反转座子的比例为4．52％， 与异源四倍体鲫鲤相比有较大差异，四倍体鲫鲤中DNA转座子的比 例低于其父本鲤鱼，然而在反转座子方面，异源四倍体鲫鲤比其父 本稍高。异源四倍体鲫鲤为红鲫和鲤鱼的杂交子代，与其亲本相比 发生了大量的基因重组、基因重排以及基因冗余的事件，而新的逆 转录因子的插入会破坏基因组的结构，导致一些冗余基因的沉默， 进而调控功能基因的有序表达