嗜热放线菌SAC的酶学分析和球形红细菌SAC的寡聚化分析.pdfVIP

本研究得到国家自然科学青年基金 、 浙江省自然科学基金 动基金项目资助 TheResearchwas theNational Supportedby NaturalScience Fundfor Scholarsof 08OoO1 Young China(39)、Zhejiang ProvincialNaturalScience of Foundation China(Y3090546)and theScientificResearchFoundationforthe Sponsoredby ReturnedOverseasChinese Education Scholars，State Ministry 嗜热放线菌SAC的酶学分析及球形红细菌SAC的寡聚化 分析 摘要 硫作为生命活动的必需元素之一参与很多的细胞代谢过程。含硫化合物在维 持细胞的氧化还原坏境、调控基因表达、缓解重金属的毒害和防御病虫害等方面 具有重要的作用。土壤中，硫主要以硫酸盐和亚硫酸盐的形式存在。细胞吸收硫 后经胞内ATP硫酸化酶(ATP 5-phosphosulfatekinase，APSK)的活化，可进一步进行硫的还原或者化合物的硫 酸化修饰。ATP硫酸化酶催化的5’腺苷磷酰硫酸(adenosine 5-phosphosulfate， APS)合成反应不易进行，研究发现很多细胞利用GTP水解酶或者多酶复合体 等硫酸盐活化复合体(sulfateactivating complex，SAC)的形式促进硫代谢。球形 活性位点。 嗜热放线菌(Thermobifida fusca)是生活在高温环境下的一类原核生物，其基 因组中含有球形红细菌(Rodobacter 讨了温度对其活性的影响。结果发现其无ATP硫酸化酶的活性，具有APSK活 SAC在室温下(25。C) 性。通过测定其在室温下的稳定性和耐热性发现，T．fusca 放置68个小时其APSK活性未发生明显的变化且61℃仍然具有对照酶活的 80％，在65C时活性丧失。球形红细菌SAC在温度达43。C时已经基本丧失酶活。 通过三维结构分析，发现TFSAC的ATPS结构域两个环状结构的缺失可能导致 ATPS活性缺失，此结构的添加并没有恢复其ATPS活性。TFSAC的发现在原有 酶反应体系。 球形红细菌SAC具有通道效应，为分析球形红细菌SAC的寡聚化对其通道 性进行测定。结果发现突变后SA214E形成包涵体，经复性后未检测到酶活，而 摘要 活性的SAC多肽链上增加具有活性的APSK，纯化后发现所得蛋白具有两种酶 的活性，为进一步分析通道效应机理及路径奠定了基础。 我们推测球形红细菌SAC的磷酸化机制与大肠杆菌APSK形成磷酸化中间物 的机制类似。希望通过对大肠杆菌APSK形成E·P中氨基酸的确定，分析球形红细 blot， 丝氨酸突变为丙氨酸，并利用抗磷酸化丝氨酸抗体对突变蛋白进行Western 以确定磷酸化的位点。结果表明此五个突