黑素瘤和色素痣BRAF、NRAS基因突变分析和黑素瘤血清microRNA肿瘤标志物研究.pdfVIP

鲜有该热点突变，不支持BRAF突变是MM发生发展的关键因素。 目前，西方发达国家已经开发出针对BRA族变的药物并应用于临床治疗。然 而，在具有曰剐脯频突变的西方群体中，此类药物也未达到理想效果。提示围绕 BRA胰变的治疗可能达不到预期目的。BRA腆变的生物学意义还有待商榷。早 期诊断是提高存活率的最有效途径，早期发现皮损并移除可以拯救90％的患者。 相反，随着疾病进展，5年存活率大大下降：ll期发现的患者5年存活率为60％，III 期则下降到lO％；一旦转移，平均5年存活率仅为5％。 功能性mRNA3’端非编码区的非完全碱基配对来抑制相应mRNA的功能，发挥调 节细胞分化、增殖或凋亡的作用。很有特点的是，50％的miRNA基因均定位于基 因组上癌症基因相关区域。与正常组织相比较，在肿瘤中已经发现有差异表达的 miRNA。数据显示，循环中存在来源于各种不同免疫细胞、组织或器官的miRNAs。 数据显示循环体液中的miRNA可以抵抗非常极端的储存条件如存在RNaseA酶、 煮沸、极端酸碱性储存液、延长存储时间及多次反复冻融等而依然保持稳定，为 研究miRNA作为不同生理病理过程的基因标志奠定了基础。多篇报道指出血清 miRNAs可以作为癌肿、炎症或心血管等疾病的检测标志。 因此本小组将工作重心转移到寻找血清miRNA肿瘤标志物的方向中来。我们 首先在小鼠黑素瘤模型中进行了初探。数据提示miR．103仅在MlVl小鼠血清可以 检测得到，而正常血清中则丰度极低(见第二部分)；同时初步检测到在MM组 小鼠和对照组血清问有差异表达miRNAs。强烈提示血清中可能存在MM肿瘤相 关的miRNA，并可以用做区分标志。 随即我们继续在MM患者血清里开始了同样的研究。可喜的是我们在MM血 清中寻找到数个差异表达基因，部分表现为表达水平上的显著性差异，另一部分 甚至在正常标本检测不到，而仅在MM血清特异表达的miRNA。经统计分析，数 个miRNAs在区分MM与健康标本方面有较高的敏感性和特异性，极有潜力用作 肿瘤标志物。 尽管我们采用了年龄、性别无差异的34例MM和34例健康对照的相对大样 本，该样本量仍不足以诠释候选miRNAs的表达与诸多不同MM病理类型和不同 2 分期之间的关系。该研究结果还需要通过引入含有更多变量的更大规模样本进一 步验证。而目前血清数据只能依赖高通量miRNA array数据分析(仅高通量时才 可应用全局标化分析)，价格昂贵。在没有合适血清内参照基因的前提下，不便于 进行单个具体miRNA的验证及扩大研究。 多个研究小组仅单纯使用在细胞中稳定表达的基因如U6、miR．16、let-7a、 miR．16和昆f．7口的差异表达甚至可以作为造血系疾病的诊断marker。因此，这些 基因并不适合作为血清内参照基因用于相关数据分析。几个研究小组尝试应用外 源性导入的与哺乳类生物基因序列相异的对照基因来标化循环中所得基因表达数 仅可以帮助标化RNA提取过程中的技术方法差异。组织细胞中miRNA的含量仅 有总RNA的0．01％，如此小的含量，在不同的标本间可能会有很大的差异，血清 标本间的miRNA含量更甚。所以，人为添加的外源性小RNA是否能代表不同标 本间的起始miRNA总量从而作为外源性对照基因尚有待进一步研究。 为解决继续延伸MM血清肿瘤标志物研究过程中遇到的难题，我们进一步寻 找血清中可能稳定表达适合用作内参照基因的miRNA。该研究将为最终寻找到 MM病理及分期相关生物标志物奠定基础。 材料与方法 一、实验对象 从国内东北、西北及西南地区有代表性的医院收集了组织病理诊断为MN或 MM，福尔马林固定石蜡包埋的组织块，东北地区另有部分OTC包埋冰冻保存组 织。绝大多数标本均来自当地汉族居民(仅l例彝族，3例藏族标本用于特殊分析)， 人口统计学信息来自当地病例记录档案。为探讨血清生物标识物的存在，从美国 FordHealth Bioresources Jackson实验室购买C57BL／6(B6)小鼠，在Henry System 自行繁殖，B16F10黑素瘤细胞株接种后获得实验用血清。本研