小鼠miR-122重组慢病毒载体的构建和鉴定.pdf.pdfVIP

岭南现代I临床外科2012年4月第 12卷第2期LingnanModemClinicsinSurgery，Apr．201 ． NO．2 · 实 验 研 究 · 小鼠miR一122重组慢病毒载体的构建和 鉴定 邱荣林 邓小耿 谢平 李治熹 唐晶 摘【要】 目的 构建携带miR．122的重组慢病毒表达载体，为研究miR．122的功能和作用 机制奠定基础 。方法 从小 鼠基因组 DNA采用 PCR法扩增出pre—miR一122基因，测序后克隆至 pCDH—CMV．MCS—EF1．copGFP逆转录病毒载体上 ，测序鉴定，病毒包装后 ，转染 NIH3T3细胞 ，并 通过绿色荧光蛋白进行病毒滴度测定。将重组慢病毒感染肝前体细胞 (HPCs)，利用实时定量 PCR检测 miR．122的表达 。结果 重组慢病毒载体 pCDH．CMV—miR．122一EF1．copGFP经PCR扩 增及测序鉴定正确 ，并得到了滴度为 (1～5)×10 IU／mL的病毒液。pCDH．CMV．miR．122一EF1一 copGFP感染的肝前体细胞中miR．122表达显著增强 。结论 成功构建了小鼠miR．122重组慢病 毒．并在肝前体细胞中高效表达出miR一122，为进行 miR一122的功能和机理奠定了良好的基础。 【关键词】 MicroRNA一122；载体构建 ；慢病毒 中图分类号 ：Q987．1 文献标识码：A 文章编号：1o09—976x(2012)02一o092—04 doi：10．3969／j．issn．1009-976X．2012．02．003 ConstructionandidentificationofmiR-122recombinantslow-viruscarrierinmice QiuRonglin． DengXiaogeng， Xie ， LiZhixi， TangJing．DepartmentofPediatricSurgery， Sunrat—sen MemorialHospital，SunYat—Sen University，Guangzhou，510120 A【bstract】 Objective Toconstructtheresturcturinglentiviralexpressionvectorthatcarries miR一122． andlayafoundationforUStostudythefunctionsandmechanismsofmiR．122． M ethods Thepre-miR一122genewasamplifiedfrom mousegenomic DNA byPCR， which wasclonedtothe retroviralvectorsofpCDH—CMV-MCS—EF1一copGFP andsequenced．Afterviralpackaging，theNIH3T3 cellswere transfeeted with recombinantlentiviral vector． Thetiterofviruswasdetected by green fluorescentproteindetermination．FinallytheexpressionofmiR·122ofhepaticprogenitorcells(HPCs) infectedwithrecombinantlentiviral vectorwasanalyzedbyusingreal—timequantitativePCR． Results PCR and DNA sequencingassaysdemonstrated thattherecombinantlentiviralvectorofpCDH．．CMV．． miR一122一EF1一copGFPwassuccessfullyconsturcted，andthetiterofconcentratedviruswas(1-5)xl0 IU／mL．ThelevelofmiR一122expressioninHPCswassignificantlyincreasedafterinfectionwithpCDH— CMV．miR．122一EF1一copGFP．Conclusion MousemiR．122recombin