最新Ch4 沉淀技术(Precipitation).pptVIP

沉淀法应用（了解内容）见讲义 利用蛋白质沉淀大规模提纯白蛋白与免疫球蛋白的工艺 柠檬酸的生产 萃取 一沉淀法提取分离茶多酚 利用蛋白质沉淀大规模提纯白蛋白与免疫球蛋白的工艺 柠檬酸的生产 柠檬酸生物技术是工业和学术界都感兴趣的领域，长期以来柠檬酸生产是发展工业生物技术并促使新老技术交接的驱动力之一。 标准沉淀法回收柠檬酸流程图 加热到70度 萃取 一沉淀法提取分离茶多酚 茶多酚是一类富含于茶叶中，主要由表儿茶素、表没食子儿茶素及它们的没食子酸酯类等组成的多羟基酚类化合物，在茶叶干品中的含量一般在20％左右 儿茶素类化合物是茶多酚的主要成分，其结构式可表示为 ： 萃取法的一般工艺路线 萃取法和沉淀法提取茶多酚工艺图 浸提溶剂:80％乙醇作为，萃取回流时间2h 萃取pH值:3～4 沉淀剂:ZnCl2 转溶:6mol/L HCl处理沉淀 茶多酚粗品:含量约70％，棕色结晶性粉末 精茶多酚:含量85％ 以上，浅黄色结晶。 思考题： 1 .盐析法为什么能用于分离蛋白质混合物？一般用于生物分离的哪个阶段？ 2 .有20ml的料液，要采用直接加固体硫酸铵的方式进行盐析，其硫酸铵的饱和度为20%，需要达到的硫酸铵饱和度为40%，问需要加入多少硫酸铵固体？ 3 .有机溶剂沉淀蛋白质的机理什么？用乙醇 沉淀蛋白质时应注意哪些事项？ 4.何为选择性变性沉淀法？ * pH值： 在接近蛋白质等电点的溶液中进行盐析有利于蛋白质的沉淀。需要注意在高盐溶液中蛋白质的等电点会发生偏移。 左图； pH值对β的影响 其中之一发生变化引起β发生变化,Ks不受影响。 β 随pH的变化规律： 由于β代表溶解度的对数，故β 变化一个单位，溶解度就变化 10倍。 β在pI附近有极小值。两种Prot 相对溶解度会随pH变化而变化很大；从图 上可见， 当 pH从5变到6时，在一定盐浓度下，两种蛋白质溶解度之比的变化可达几千倍。 在一定的浓盐溶液中，调节蛋白质混合溶液的pH，在β差别相对较大的区域里能达到选择性沉淀。 如酵母提取细胞色素C：先调节pH为5.0-5.5，加硫酸铵使饱和度达85%，冷室静置后→杂蛋白沉淀→离心后再调节pH4.8-5.1 →产生红色的细胞色素C。 （pH6.6） （T25℃） 1、硫酸铵盐析法实际应用时的注意点： （1）（NH4）2SO4加入后，会使溶液pH略变酸，为保持pH中性，可加入50mmol/L的磷酸缓冲液； （2）（NH4）2SO4的溶解度在0～30℃变化很少，20℃的饱和溶液的浓度为4.05mol/L（534g/L）饱和溶液密度为1.235kg/L。用1L的水加（NH4）2SO4至饱和，需加入761g固体硫酸铵，体积增至1.425L。 （五）盐析沉淀的操作 1）饱和度是指溶液饱和硫酸铵的体积与溶液总体积之比。 如：70ml酶液+30ml饱和硫酸铵溶液，则混合液中硫酸铵的浓度为 30/（70+30）=0.3饱和度=30%P 。 250C时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L 定义为100%饱和度 2、硫酸铵加入量的计算 ① 盐析时所需添加的饱和硫酸铵的体积： V=V0 (mL) 2）饱和硫酸铵溶液的配制方法： V、V0—分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原来溶液的体积（mL） S2、S1—法分别为所需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度 ②直接加固体硫酸铵到被分离的溶液中，按下式  计算加入量：W= （g） W—为将1L、S1饱和度的溶液提高到S2 饱和度时，所需加入的固体硫酸铵的克数（g）。 S2、S1—分别为所需达到的硫酸铵饱和度和原来 溶液的硫酸铵饱和度（均用小数表示） A、B——常数，与温度有关。 在0℃时， A为0.27 B为505 在20℃时 A为0.29 B为534 （当盐析要求的饱和度高，又不宜增大溶液体积时，可直接加硫酸铵的固体盐） 0℃ ，G= (已考虑体积的增加) 20℃ ， G= （已考虑体积的增加） 20℃ ， G= （已考虑体积的增加） 因此，如果我们说，沉淀某一种蛋白质需要60%饱和度的硫酸铵，那么需要硫酸铵固体的量是多少？ ①粗提目标产物(如Prot )时常用Ks 分级盐析法，进一步纯化时常用β分级盐析法 ②加入(NH4)2SO4 的两种方法 ③通过小试实验确定