ndv lasta株基因组全长cdna载体和np、p辅助质粒的构建及鉴定.pdfVIP

新城疫病毒LaSota株反向遗传操作系统的初步建立 摘 要 新城疫病毒(Newcastle 许多禽类的一种高度接触性疫病，对全世界养禽业导致巨大的损失。从上世纪人们 开始用新城疫疫苗免疫，至今仍未根除本病。目前以新城疫病毒作为疫苗载体在人 与动物都进行着广泛的研究。因为NDV具备很多作为疫苗载体的优势，NDV作为 疫苗载体接种途径简单，高滴度，低成本；其血清型只有一种，有相对的遗传稳定 性，毒株间不易发生重组，毒力返强性小；在细胞浆内完成复制，从RNA到RNA， 不会与细胞基因组整合；可稳定表达外源基因等。 反向遗传操作技术的基础和应用研究，对RNA病毒具有革命性的意义，新城疫 病毒利用这技术的研究也极为广泛深入。要启动病毒的转录复制，除病毒基因组 RNA外，还需要病毒基因组的NP蛋白与病毒基因组RNA形成核糖核蛋白复 合物(RNP)，P蛋白和L蛋白形成大聚合酶复合物，共表达启动病毒的复制。 故拯救新城疫病毒，不仅需要病毒基因组全长cDNA，辅助质粒的构建也是必 不可少。本研究取得的结果如下： 1．病毒基因组cDNA全长载体的构建 将NDV接种9．10日龄的鸡胚，孵育7天，提取尿囊液中病毒I州A，反转录成 eDNA。根据病毒基因组序列和载体中酶切位点的分析，分七个片段扩增病毒基因。 选择载体pBR322作为转录载体，将丁肝病毒核酶序列和T7终止子连接其中得载体 IIKS+， 长cDNA载体。 2．辅助质粒pCl．NP、pCl．P的构建与表达鉴定 通过RT-PCR、Westernblot、间接免疫荧光检测NP、P基因在细胞中的表达。 RT-PCR检测分别都有特异性的条带；Western 特异性条带，P蛋白在约43KD处有褐色特异性条带；间接免疫荧光检测NP蛋白、 P蛋白能看到较多荧光。说明辅助质粒pCl．NP和pCl．P构建成功。 本研究成功的构建了病毒基因组eDNA全长载体和辅助质粒pCl．NP、pCl．P， 为本实验室可开展新城疫病毒的反向遗传学操作系统的研究奠定了基础。 关键词：新城疫病毒(NDV)；反向遗传学：全长cDNA；NP、P： II 新城疫病毒LaSota株反向遗传操作系统的初步建立 ABSTRACT Newcastledisease RNAviruseswinl virus(ND)isnegative·strand is diseasethat Canbe hascaused genomes，NDcontagious manypoultry infected，which lossesin diseasevaccineshavebeenusedsincethelast industry．Newcastle huge poultry thediseasehaven’teradicated diseasevirususedas century,but yet．Currently,Newcastle avaccinevectorwascarriedout researchinhumansandanimals．Asa extensively vaccine has as to vector,NDVmanyadvantages，sucheasy one in torestructure low-cost；onlyserotype，relativestabilityhereditary,lesspos