共表达h5亚型流感病毒ha基因和鸡il--6基因重组鸡痘病毒的生物安全评价.pdfVIP

共表达H5亚型禽流感病毒HA基因和鸡lL．6基因重组鸡痘病毒的生物安全评价 共表达H5亚型禽流感病毒HA基因和鸡IL．6基因重组鸡痘病 毒的生物安全评价 jIMIIIIIIIIIIII IIIMIJlIIIIIIIIf 研究生：娄亚坤 导师：彭大新教授 陈素娟副教授 刘秀梵教授 摘要 influenza 禽流感病毒(Avian virus，AIV)已成为危害养殖业、公共卫生的重要病原之 一，灭活疫苗虽然在禽流感的防控中起到重要作用，但存在仅能诱导体液免疫、成本高等 缺点。因此，研究者们正着力研制新型的基因工程疫苗。以鸡痘病毒为载体表达外源抗原 蛋白的重组疫苗研究已十分成熟。目前对重组鸡痘病毒疫苗的免疫原性研究较多，对其生 物安全评价较少，同时，重组活载体疫苗的生物安全评价是疫苗能否应用到临床上关键因 素。本实验室构建的共表达H5亚型禽流感病毒HA基因和鸡IL一6基因重组鸡痘病毒 (Recombinantfowlpox 开展重组鸡痘病毒在水禽体内的生物安全评价。 1重组鸡痘病毒的理化特性与生物学特性研究 virus，FPV)疫苗株分别在不同温度、pH、氯仿、 rFPV与母本野生鸡痘病毒(Fowlpox 计算各代次比例，来评价重组鸡痘病毒与母本病毒的竞争性。试验结果表明，rFPV与FPV 均对胰酶和氯仿敏感，在pH3～9的范围内具有一定的耐受性，对高温敏感。与野生株共传 代，其复制竞争能力弱，因此，rFPV比野生鸡痘病毒疫苗株具有更高的生物安全性。 2重组鸡痘病毒免疫麻鸭的生物安全性评价 105PFU／ 10日龄商品麻鸭随机分成6组，每组40只，颈部皮下分别免疫rFPV-HAIL6 只(O．2mL)，rFPV-HAIL6106PFU／只，rFPV-HA105PFU／只，FPV105PFU／只，高致病性H5N1 亚型禽流感油乳剂灭活苗O．2mL／只，PBS 有5只同居感染的麻鸭。在免疫后第1、7、14d采集麻鸭试验各组麻鸭外周血测定其血液 Il 共表达H5亚型禽流感病毒HA基因和鸡lL_6基因重组鸡痘病毒的生物安全评价 理化指标变化情况，在免疫的1、3、7d同时随机扑杀3只做病毒体内分布试验及组织病 理学观察；在免疫后2ld每隔1w称量实验各组的麻鸭体重分析rFPV对麻鸭增重影响； 在免疫后21 居感染能力；在免疫后的1、3、7、14d采集实验各组的饲料、粪便、饮水、喉头及泄殖 腔棉拭子分离病毒，评价rFPV的水平传播能力；在免疫后60 免疫部位肌肉通过southernblot的方法评价重组痘病毒外源基因整合麻鸭染色体DNA的可 能性；在动物试验期间每隔1w采集试验各组麻鸭外周血通过HI或者ELISA的方法测定 龄麻鸭，在接种后4d采集接种部位肌肉，研磨，取研磨液接种10日龄麻鸭，如此盲传5 代次，取每代次的接种部位研磨液接种CEF分离病毒。 试验结果显示，重组鸡痘病毒对麻鸭的血液理化个别指标有影响，2w后恢复至正常 水平；组织病理学观察未发现明显病变；对麻鸭增重无影响；体内分布试验显示在麻鸭体 内除接种部位外其他组织脏器分离不到病毒，PCR可以检测各个组织病毒核酸，免疫组化 结果可以检测到rFPV在各组脏器表达的外源蛋白；同居接触不会水平传播；未从饲料、 粪便、饮水及棉拭子中分离到病毒不会污染周围环境，对周围环境安全；Southernblot试 验表明，外源基因不会整合到麻鸭染色体DNA中；鸭体内盲传，只能从第一代次麻鸭体 内分离到病毒，表明病毒不能连续在鸭体内传播，不会发生毒力返强。 3重组鸡痘病毒免疫鹅的安全性评价 重组鸡痘病毒以106PFU免疫10日龄小鹅，同