动物rna病毒向遗传系统的研究和建立.pdf

摘要 针对非逆转录RNA病毒发展起来的病毒反向遗传学可以实现对RNA病毒基因组结构与功 能、复制与表达、病毒致病机制等研究。本研究用T7RNA聚合酶系统和聚合酶I系统为基础建 立了体内外拯救方法并初步进行应用． 一、SVDVHK／70株生物特性测定、生物信息学分析及以37RNAP为基础的体外病毒拯救 方法的建立和应用 为了建立以I7RNA聚合酶系统为基础的体外拯救病毒方法，选择猪水泡病病毒(SVDV) HK／70株作为细胞质复制的RNA病毒的研究模型。首先。分离和鉴定了该病毒，并测定了该病 的一些生物学特性。然后，构建了SVDV全长eDNA并进行序列测定，以此为基础，分析了其相 RNA聚合酶系统在体外进行转录，将获得的 株的全长eDNA质粒(pSVOKl2)为模板，应用T7 RNA用脂质体转染法导入IBRS-2细胞，传代培养．可以观察到典型的SVDV致细胞病变效应。 使用反向血凝鉴定试验、间接免疫荧光实验、RT-PCR和序列测定进行检测，结果表明，从猪水 泡病病毒全长eDNA拯救出了猪水泡病病毒(G—SVDV)；利用常规负染的方法，电镜观察了 HK／70的感染性 与亲本毒的毒力差别不显著。本研究结果证明，我们已经成功构建了猪SVDV cDNA克隆，为进一步探索SVDV病毒致病的分子机制及研制新型SVD疫苗奠定了忘好的基础· 二、以T7RNAP为基础的体内病毒拯救方法的建立和应用 RNA 为了建立高效的体内病毒拯救系统，我们利用逆转录病毒转导技术建立了稳定表达T7 聚合酶的细胞系。先克隆出T7RNAP基因，定向克隆进逆转录病毒载体pBABEpuro，得到阳性 RNA聚合 重组质粒pT7BABEpu∞。共转染包装细胞，获得含有VSV-G膜的假型病毒，含有T7 酶基因。然后把该假型病毒感染靶细胞，把I7 细胞的基因组内。通过抗性筛选，获得了稳定表达具有转录活性T7RNA聚合酶的细胞系。通过 RNAP能够被稳 PCR、间接免疫荧光和流式细胞仪(FCM)等技术进行鉴定，结果表明，该T7 RNAP具有较好的转录活性，其活性传代不减弱。 定地整合进靶细胞基因组内，细胞系内的I7 最后，利用该细胞系成功拯救出具有感染性的SVDV，并与亲本毒的生物学特性作了比较。该策 C株进行了拯救，进行了 略使RNA拯救方法简化为一步快速的拯救方法。利用该方法对CSFV 拯救病毒的鉴定，并傲了兔子致病性试验． 三、以真核细胞RNA聚合酶I系统为基础的体内拯救系统的建立和应用 为了克服那些难以适应甚至没有可适应细胞系的病毒拯救难题，设计构建了完全利用真核细 胞聚合酶的RNA病毒体内拯救系统。先克隆出所需的真核RNA聚合酶I启动子和终止子序列， 细胞内和乳鼠体内成功拯救出了SVDV，第一次证明了聚合酶I系统能够高效拯救细胞质复制的 正链RNA病毒。并利用该拯救系统对FMDV进行了拯救，首次证明该聚合酶I系统能够转录出 至少长8．2kb的转录本。在此基础上，构建含有外源性生物标记5819的SVDVHK／70全长cDNA 克隆。利用聚合酶I反向遗传拯救系统拯救出含有该标记的病毒。为制备含有基因标记疫苗和建 立鉴别诊断方法奠定一定的基础。该设计思路的实现，拓宽了高效病毒拯救的途径，为病毒反向 遗传学研究提供了更为高效和广泛应用的病毒拯救技术方法。 关键词：反向遗传学，病毒拯救系统，17 Ⅱ Abstract Thercvelse ofRNAvirusallows genetics pre