堆形艾美耳球虫子化卵囊cdna文库构建与抗原基因筛选.pdfVIP

摘 要 鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于鸡肠道所引起的一种危害严重的全球性寄生虫病，给养 鸡业造成巨大的经济损失。目前控制球虫病的主要方法包括化学药物防治和疫苗免疫预防， 但由于这些方法存在安全、价格以及抗药虫株出现等问题，迫切需要寻找新的防治手段来控 制球虫病。研制高效安全抗球虫病基因工程疫苗的关键在于寻找到重要的虫体抗原基因． 本研究首先利用传统生物学方法对实验所选的堆形艾美耳球虫(Eimeriaacervu／ina)虫株 进行了鉴定，包括潜在期、寄生部位、最短孢子化时间、卵囊形状、卵囊大小及孢子囊大小 等．利用SMAR．T1MeDNA文库构建试剂盒成功构建了堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文 106 010 库，文库库容量为4．7Kpfu／mL，重组率为98％；扩增后的文库滴度为4．4×1p,fu／mL， 插入片段平均大小约为1000 bp。用堆形艾美耳球虫孢子化卵囊可溶性抗原免疫兔血清筛选 000 构建的eDNA文库，获得6个阳性克隆，PCR鉴定l～3号阳性克隆的插入片段大小约为1 500 bp，4-6号克隆约为1bp。随机选取1个阳性克隆(duil0)进行测序，将所得序列与 1个完整开放阅读框，编码1．63个氨基酸，生物信息学分析显示该新基因含有1个蛋白激酶 C磷酸化位点、1个N．糖基化位点、2个酪蛋白激酶1I磷酸化位点、4个N端豆蔻酰基化位 点。另外，利用PCR方法从构建的堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库中扩增出了巨噬 migrationinhibitoryfaaor，MIF)，将该基因连接到原 细胞移动抑制因子基因(maerophage 组蛋白pET28a-MiF具有良好的抗原性。 本研究成功构建了堆形艾美耳球虫孢子化卵囊eDNA文库，通过免疫筛选获得1个新 基因，从该cDNA文库中成功克隆了MIF，并在原核表达系统中进行表达。研究结果为鸡 球虫候选基因工程疫苗靶分子和新治疗药物靶标的筛选奠定了基础。 关键词：球虫，堆形艾美耳球虫，cDNA文库，免疫筛选，基因克隆 Abs仃act Avian coccidiosisisthe diseaseof infected majorparasitic Eimeriainflicts poultry bY spp．It severe economicOil lossesthe disease poultryindustry．At control haverelied present,conventional on strategies medicationandimmunization prophylactic withlivevaccines．Duetothe of resistant emergence drug andthe of livevaccines parasite danger