多重pcr检测致病性大肠杆菌毒力基因方法的建立及应用.pdfVIP

中文摘要 随着养禽业迅速发展，各类细菌性疾病日益严重，特别是大肠杆菌病一直是 限制养禽业发展的最主要的疾病之一。为建立一种特异性的禽大肠杆菌病检测方 序列的保守区，设计并合成5对特异性引物，建立一种同时检测APEC5种毒力 基因的多重PCR方法，并应用此方法检测APEC安徽分离株的毒力基因。结果 如下： 1．APEC中papC、iucD、irp2、砌、嫱单基因PCR扩增 根据APEC的致病机理，从细菌的粘附定居、参与铁摄取和增强血清抗性等 杆菌素基因iucD、温度敏感性血凝素基因砌、铁抑制蛋白基因办p2、血清抗性 蛋白基因￡路的序列，设计并合成5对特异性引物。以E．coli 0l(CVCC249)、 单基因PCR扩增，以筛选多重PCR的阳性对照。经过预实验得到的PCR反应 清型的菌株中5种基因的检出率均为100％，因此均可用做阳性对照的模板。选 BLAST2 苷酸序列测定，并提呈NCBI 行基因同源性分析。结果显示所得的片段与预计的基本一致，且同源性在98％～ 99％。 根据单基因PCR扩增条件，通过逐步优化引物组合浓度、镁离子浓度、Taq DNA聚合酶量、退火温度、延伸时间、循环次数和DNA模板提取方法等条件， 建立了同时检测5种毒力基因的多重PCR方法。所建立的多重PCR反应体系为 度为102cfu·mEl，且具有特异性。 3．APEC安微分离株毒力基因的多重PCR检测 应用所建立的多重PCR方法检测了9株APEC安徽分离株，以验证所建立 的多重PCR方法的实用性，并确定了9株APEC安徽分离株的毒力基因型。分 基因的多重PCR扩增。结果1株鸭源和3株鸡源的APEC中均扩增出4条毒力 基因条带，1株鹅源和4株鸡源的APEC中均扩增出5条毒力基因条带。在9株 的携带率为55．6％。9株APEC安徽分离株分布于两个毒力基因型，其中5株为 表明iss、irp2、papC和iucD基因广泛存在于APEC中。 以上研究表明，本文建立的多重PCR方法可从APEC分离菌株中检测出任 何一种或任何组合的毒力基因，其特异性强，准确性好，敏感度可以达到102 cfu·niLl。因此，本方法在禽大肠杆菌病的早期诊断、分子流行病学调查和禽制 品APEC污染的检测中具有重要的应用价值，为进一步从分子水平揭示APEC 的致病机制提供研究基础。 关键词：禽致病性大肠杆菌，毒力基因，多重PCR，检测方法 lI Abstract Withthe of bacterialdiseases rapid poultryindustry，various development become avian isoneofthemost colibacillosis，which serious，especially important dieases the of ordertoestablisha restrictinggrowth industry．In poultry special methodfor colibacillosis PCRhasbeenastablished．This diagnoses，amultiplex could method fivevirulence，asscoiatedin amplify genesAPEC，concloudingpa