家蚕与野桑蚕cp6b29基因的克隆、序列分析及原核表达.pdfVIP

家蚕与野桑蚕cyP卯猡基因的克隆、序列分析及原核表达 中文摘要 中文摘要 细胞色素P450单加氧化酶系在生物体对外源化合物的代谢和内源化合物的 调节都起着非常重要的作用，许多证据表明昆虫杀虫剂抗性的产生与单加氧化酶 系介导的代谢反应有关，其关键组份细胞色素P450作为终端氧化酶能氧化多样 的底物。 以家蚕基因组P450序列为依据，设计了一对引物，采用RT-PCR方法分别以 对分子质量约为58kD，等电点分别为8．29和8．49。同源EB较发现两者有12个碱 基、6个氨基酸的差异，核苷酸和氨基酸同源性分别达到99．2％和98．8％。经与已 知P450的6B亚族其它几乎所有成员氨基酸同源比对发现，家蚕和野桑蚕 CyP卯刀基因与美洲棉铃虫CYP6827同源关系最近，同源性分别达到60．5％和 61．3％。P450的6B亚族的许多成员与昆虫对杀虫剂的抗性和植物毒素的代谢相 关，因此推测其可能与昆虫抗性相关。 将家蚕和野桑蚕CYP6829基因分别克隆进原核表达载体pET-28a，转化到大 肠杆菌BL21细胞中，经1mmol／LIPTG诱导蛋白质表达。SDS．PAGE电泳分析 表明在约62 菌和空pET-28a转化BL21菌相比都出现了一条特异性的蛋白质条带，推测家蚕 和野桑蚕CYP6829在大肠杆菌中得到表达。然后通过Westernblot分析表明在预 期的约62 kD大小位置出现较明显的条带，而对照BL21菌和空pE％28a转化BL21 菌都没有检测到条带，进一步证明了家蚕和野桑蚕CYP6829得到了成功表达。但 在此预期的约62 kD大小位置以下出现了几条小分子量条带，而且家蚕和野蚕几 乎完全相同。经序列分析表明，这两个基因内部含有大量大肠杆菌稀有密码子， 约占到1／10，因此推测这几条较小的蛋白质条带是由于基因的不完全表达造成的。 家蚕与野桑蚕cyP6829基因的克隆、序列分析及原核表达 中文摘要 家蚕和野桑蚕CYP6829基因的成功表达为进一步通过构建P450体外重组体 系，研究对外源物质的代谢，最终确定其功能打下了基础。 关键词：家蚕；野桑蚕；CYP6829；序列分析；原核表达 作 者：王东 指导教师：沈卫德 H 家蚕与野桑蚕CYP6829基因的克隆、序列分析及原核表达 英文摘要 Cloning，sequenceanalysis，andprokaryotic of CYP6829from moriand expression genes Bombyx mandarina Bombyx Abstract The arean cytochromeP450一dependentmonooxygenasesextremely important metabolic involvedin and and thecatabolismanabolismofxenobiotics system has to with