小鹅瘟单克隆抗的研制及应用研究.pdfVIP

摘要 小鹅瘟是一种传播快、死亡率高的传染病。由于其病情急、病程短，因此，早发 现、早治疗对控制本病十分重要。近年来，小鹅瘟病多继发其他疾病或与其他传染性 疾病并发，其临床症状和病理解剖都缺乏特征性，这样就给疾病的诊断和防治造成巨 大困难，必须通过试验室诊断方可确诊。 目前实验室诊断方法有病毒的分离鉴定、琼脂扩散试验、聚合酶链式反应等数种， 它们或存在耗时长、敏感性低，或存在设备昂贵等缺点。酶联免疫吸附试验(ELISA) 方法具有方便、敏感和快速的特点，可以直接检测出病料中的小鹅瘟病毒，但是由于 其超敏感的特点，也易造成假阳性和假阴性结果，只有用纯化的抗原或者抗体，才可 以避免假阳性和假阴性的结果出现。与上述几种实验室诊断方法相比，酶联免疫吸附 试验(ELIsA)对仪器设备要求不高，临床上容易做到，如果利用纯化的抗原或者抗 体便可以避免假阳性和假阴性的结果出现，单克隆抗体便可弥补这个缺陷。与常规抗 体相比，单克隆抗体纯度更高，特异性更好，并且一经研制出，便可大量地生产。如 使用酶标单克隆抗体来进行ELISA试验以鉴定小鹅瘟病毒，就可以将ELISA方法和 单抗的优点结合起来，为快速、准确诊断小鹅瘟探索一种新方法。这便是本论文目的 所在。 由于ELISA试验结果受试验工作条件影响很大，而文献报道的试验条件不尽一 致。本文首先对间接ELISA的各步工作条件进行了比较和筛选，建立了稳定、可靠 的ELISA检测方法。 其次，通过淋巴细胞融合技术，以50％PEG(分子量3350)作为融合剂，将以 ELISA试验筛选出阳性细胞，扩大培养并亚克隆。最后研制出6株抗小鹅瘟病毒(GPV) 杂交瘤细胞阳性株注射BALB／C小鼠制取腹水后测定其效价达lO巧。以间接ELISA 法测定单克隆抗体特异性，鉴定单克隆抗体亚类，结果表明所得到的均为IgGl型单 抗，并且特异针对小鹅瘟病毒。测定冻存前和冻存后20天杂交瘤细胞上清液间接 ELIsA效价，通过效价的变化，评价所获得的杂交瘤细胞对于冻存的稳定性，结果表 明杂交瘤细胞对于冻存有较好的稳定性。 最后，利用获得的抗小鹅瘟单克隆抗体与HRP交联，建立了快速、特异检测小 鹅瘟病毒的间接夹心ELISA法。用得到的辣根过氧化物标记的单抗傲EuSA以检测 病毒不反应，仅与本实验的OPV毒株反应。说明用该方法诊断小鹅瘟病毒具有良好 的特异性。用得到的辣根过氧化物标记的单抗做双抗夹心ELISA以检测健康、人工 发病和自然发病鹅的组织样品，并做鹅胚接种-病理观察-琼脂扩散试验作为对照。结 果表明：用辣根过氧化物标记的单抗ELISA法，24h即检测出小鹅瘟病毒，检出时间 明显短于鹅胚死亡时间(，O．05)；且该方法可以检测出更多的器官中的病毒，也 可以检测出弱毒性病毒。这些结果表明该方法有利于快速、特异性检测小鹅瘟病毒， 具有良好的应用前景。 关键词：鹅小鹅瘟病毒单克隆抗体ELISA诊断 Ⅱ Abstract to and diseasehas Parvovius．This Parvovirus(GPV)，whichbelongsParvoridae，Parvorinae causeda economiclossestothe in the around hllge geesepoultry world，so young industry the andtreatmentofitearlieris diagnosis extremelyimportant．Thisexperimentattempted totakethe oftheELIS八s methodandthemonoelonal