布鲁氏菌实时荧定量pcr检测方法与血清快速诊断试纸的初步研究.pdfVIP

中文摘要 布鲁氏菌病（Brucellosis ，简称布病）是由布鲁氏菌引起的一种人兽共患传染病。 危害人畜健康并给畜牧业发展造成巨大损失。该病在世界范围内广泛流行，我国也是布 病的高发国家，新疆、青海、西藏、内蒙古等地区尤为严重，有效的检疫是预防和控制 布鲁氏菌病的重要手段，传统检测方法存在易发生交叉反应、操作繁琐、敏感性低等缺 点，研究敏感、特异、快速、适合临床应用的检测方法已引起了国内外的高度重视，本 实验建立的布鲁氏菌实时荧光定量 PCR 与血清快速诊断试纸检测方法，将会为基层布 病检疫和防控提供技术支持。本实验所做的工作及主要成果如下： 1. 布鲁氏菌BP26 蛋白的表达、纯化。将bp26 基因克隆到pGM-T 载体，进行酶切、 PCR 及测序鉴定后，构建重组质粒 pET-28a-BP26 ，转化表达菌并诱导表达、纯化， Western-blot 分析其免疫原性。结果表明正确构建了pGM-T-BP26 ，成功表达了BP26 融 合蛋白，SDS检测表明获得了高表达量、高纯度的蛋白，并且布鲁氏菌阳性血清 能特异性与BP26 蛋白相结合，表明具有免疫原性，为后续的免疫学检测试验奠定了基 础。 2. 建立基于布鲁氏菌 BP26 蛋白的血清快速检测胶体金免疫层析试纸条。以胶体金 标SPA 和布鲁氏菌BP26 蛋白制备免疫层析试纸条，并对其特异性、敏感性、准确性和 稳定性进行检测。结果试纸条检测布鲁氏菌阳性血清为两条线，检测其他细菌抗血清只 有质控线显色，5-10min 可观察结果，具有良好的特异性；采用该方法、琥红平板、试 管凝集分别检测45 份布鲁氏菌M5 免疫的小鼠血清，阳性率分别为95.6 ％（43/45 ）、86.7 ％(39/45)和93.3 ％(42/45)，试纸条与琥红平板的符合率为90.6%，与试管凝集的符合率 为97.9%，试纸条可检出1:100 倍稀释的羊阳性血清；1:128 倍稀释的小鼠阳性血清，表 明具有较好的敏感性；本试纸条在4 ℃可保存6 个月，表明该检测方法具有较高的稳定 性。 3. 利用二重实时荧光定量PCR 技术建立鉴别诊断布鲁氏菌和结核杆菌的方法。筛 选布鲁氏菌omp10、omp19、omp17、omp25、omp31 和结核杆菌cfp10 基因的最佳引物 组合，建立二重实时定量 PCR 鉴别诊断方法，对该方法进行稳定性、特异性和敏感性 试验，并对临床样品及模拟样品进行检测。经筛选布鲁氏菌的 omp25 基因与结核杆菌 cfp10 基因引物组合最佳，该二重实时荧光定量PCR 方法中布鲁氏菌Tm 值为 88℃-89 ℃，结核杆菌Tm 值为 90℃-92℃，对其他供试的菌株则为阴性；该方法对布鲁氏菌的 DNA 最低检出量为 20 copies/ul ，结核杆菌为 50 copies/ul ，两病原都存在时为 100 copies/ul ，比常规PCR 高 100 倍。利用所建立的二重荧光定量PCR 方法及常规PCR ， 对 34 份结核痰样、11 份布鲁氏菌基因组 DNA 及 30 份模拟奶样进行检测，符合率为 100%。结果证明本实验建立的方法可用于同时检测布鲁氏菌和结核杆菌，并且具有良 好的特异性、敏感性和准确性。 关键词：布鲁氏菌；荧光定量PCR ；布鲁氏菌血清；胶体金免疫层析 I Abstract Brucellosis is a zoonotic disease caused by the genus Brucella, gram-negative, intracellular bacteria. It is endemic in various parts of the world, especially in China of the Xinjiang, Qinghai, Tibet and Mongolia province. The disease results in considerable economic losses and represents an important human