布鲁氏菌疫苗株5-90wboa、pgm缺失株的构建及免疫效果的初步评价.pdfVIP

摘 要 布鲁氏菌病 (Brucellosis) 是由布鲁氏菌引起的一种广泛流行、人畜共患的慢性传染病，不仅给 畜牧业造成重大经济损失，而且严重危害着人们的健康。目前，疫苗接种是预防该病的主要手段。 我国自主研制的M5-90 疫苗株对预防绵羊和山羊布鲁氏菌病起到了积极的作用，但由于无法区别自 然感染和疫苗免疫，给布病的临床血清学诊断和流行病学调查等造成了障碍，加之该疫苗毒力强、 容易引起怀孕母畜的流产等缺点，使得该疫苗的应用受到很大限制。为此，本研究开发了一种有效 区分自然感染和疫苗免疫的布鲁氏菌弱毒基因缺失疫苗，为布鲁氏菌病的防控提供技术支持。 以热灭活的布鲁氏菌M5-90 为模板，分别扩增WboA 基因和 pgm 基因的上下游同源臂序列，以 枯草杆菌和pEGFP-N1 质粒为模板，分别扩增SacB 基因和gfp 基因，将扩增序列连接于pMD18-T + simple 载体，双酶切后将上下游同源臂序列和 gfp 基因连接至自杀载体pGEM-7Zf 上，分别得到 pGEM-7zf- ΔWboA 和pGEM-7zf- Δpgm -gfp ，再将SacB 基因单酶切后分别连接至以上两个载体中， 电转化布鲁氏菌M5-90 感受态细胞，筛选ΔWboA 和 Δpgm 基因缺失株，以小鼠为试验动物，进行 6 缺失株的毒力评价；分别用3.0×10 CFU 剂量的ΔWboA、Δpgm 和M5-90 疫苗株接种BALB/c 小鼠， 用ELISA 方法检测小鼠外周血血清中抗体IgG 及细胞因子IL-2 、IFN-? 的含量；用流式细胞仪对小 + + 鼠外周血中CD4 、CD8 T 淋巴细胞进行分析，并对免疫30 天后的小鼠进行攻毒试验评价其免疫保 护性；根据GenBank 中发表的羊种布鲁氏菌16M 的WboA 基因和pgm 基因序列设计引物，用PCR 方法扩增M5-90 的WboA 基因和pgm 基因的编码序列，克隆到原核表达载体pET-28a ，导入大肠杆 菌DE3 诱导表达，将获得的目标蛋白用 Ni-NTAAgarose 试剂盒进行纯化，并进行Western blot 分析； 将纯化的 WboA 蛋白和pgm 蛋白作为抗原，用M5-90、ΔWboA 和Δpgm 疫苗免疫的小鼠血清作为 一抗进行Western blot 分析，检测ΔWboA 和Δpgm 疫苗免疫的小鼠血清中是否存在抗 WboA 蛋白和 pgm 蛋白的抗体。用虎红平板凝集试验和试管凝集试验检测免疫小鼠的抗体水平。 成功构建并筛选了遗传稳定的布鲁氏菌疫苗株M5-90 ΔWboA 缺失株和Δpgm 缺失株，15 代内 未发生回复突变。布鲁氏菌M5-90 ΔWboA 基因缺失株比亲本株M5-90 的毒力明显减弱且免疫保护 性略低于亲本株，Δpgm 基因缺失株与亲本株的毒力相当但免疫保护性高于亲本株；成功表达并纯 化了WboA 蛋白和pgm 蛋白，Western Blot 证实ΔWboA 基因缺失株和Δpgm 基因缺失株不能诱导 小鼠产生抗WboA 蛋白和抗pgm 蛋白的抗体；两株基因缺失株采用虎红平板凝集试验和试管凝集试 验不发生凝集反应。 关键词：布鲁氏菌M5-90 ；WboA 基因；pgm 基因；免疫保护性；鉴别诊断 I Abstract Brucellosis is a extensively zoonotic and chronic infectious disease caused by Brucella. It caused serious calamity to animals and serious harm to human. Fortunately, Vaccination is the most suitable approach to control