应力与铁皮石斛生长及其相关基因表达和克隆研究.pdf

Ph.D. Dissertation of Chongqing University Study on stress and the growth of Dendrobium candidium and its related genetic expression and gene clone Ph.D. Candidate: Li Biao Supervisor: Prof. Wang Bochu Major: Biomedical Engineering College of Mechanical Engineering Chongqing University March 2007 摘 要 随着Bio+X学科的兴起，物理学与植物学的交叉与融合已受到国内外学术界的 关注。国内外学者研究发现：人为机械力加载对植物细胞的生长、分裂具有显著 的调控作用，且在适度的应力加载下植物细胞均优先性垂直于应力矢量的伸长生 长。然而，对于植物细胞的机械力信号感受、信号转导机制的理解，以及应力对 药用植物的生长代谢及分子表达调控有何影响等方面，目前的研究工作都只是提 供了零星的实验结果，尚无系统、完整的途径解释。 本课题以珍贵的药用植物铁皮石斛为研究对象，基于已有的工作基础及研究 方法，利用声波应力加载、生化检测、基因筛选克隆、和功能基因的生物信息学 预测等多学科的研究手段和先进方法，研究声波应力干预植物的生长代谢相关的 抗氧化酶系统、代谢产物的含量变化、相关酶基因片段的扩增与表达、特异表达 基因的筛选克隆及其生物信息学功能预测，实验结果为揭示物理应力对植物生长 代谢调控机制提供基础依据和直接的分子生物学证据，为药用植物代谢产物的提 高作新方法的尝试，为寻找应力作用植物的功能基因和功能蛋白作前期工作。本 实验取得的研究结果如下： 1．声波刺激对铁皮石斛生长影响：研究发现，适当的声波应力（频率1000Hz、 声强100dB）对铁皮石斛组培苗的生长起明显的促进作用，超出一定范围时对其生 长有抑制作用，这与本实验室在菊花和拟南芥等模式植物中的研究结果相一致。 但在测定声波刺激对铁皮石斛叶、茎、根等不同生长器官的抗氧化性酶活性的影 响时又发现，在应力作用下，铁皮石斛抗坏血酸过氧化物酶（APX ）、过氧化氢 酶（CAT ）、超氧歧化酶（SOD ）和过氧化物酶（POD ）等几种主要抗氧化酶的 活性普遍得到提高，如叶、茎和根中的APX活性平均提高了15.7%、29.5%和21.5% ， CAT活性分别提高了12.3%、8.5%和26.6% ；这也显示，不同的抗氧化酶响应应力 刺激的形式都有所差别。同一种酶，对声波应力的响应在不同生长器官中的差别 也较大，如茎的POD活性比根的对应力刺激要敏感，SOD活性根比茎叶反应要迟 钝。结果说明，声波刺激植物组培苗可能造成植物细胞活性氧（AOS ）迸发，以 刺激植物细胞增殖，促进植物生长。推测AOS在应力信号传递的过程中，可能是 一种重要的信号分子。 2 ．声波刺激对铁皮石斛代谢产物含量的影响：在声波刺激下，铁皮石斛多糖 含量提高较为显著，刺激组含量均高于对照组，平均提高了8.8 ％；总生物碱的含 量提高了0.022% ；可溶性蛋白质含量平均增加了14.4%，其变化呈现逐渐升高后逐 渐降低的趋势；脯氨酸的含量变化呈现波浪态势，差异不很显著；丙二醛含量刺 I 激组较对照组降低了4.9% 。结果表明，声波刺激对铁皮石斛的代谢产物影响比较 显著，有利于铁皮石斛多糖的积累，刺激了可溶性蛋白质含量的提高，声波刺激 很可能改善了代谢产物关键酶活性，促进或抑制相关代谢产物的含量，从而使植 物适应应力刺激。 3 ．声波应力对铁皮石斛POD 同工酶基因表达的影响：应力刺激没有诱导出新 的酶带出现，分子杂交结果与酶谱学一致。就整体而言，声波应力在一定的时间 内能够增强植物POD基因表达，但对某一具体POD基因是起促进作用还是起抑制 作用需要具体分析。 4 ．特异表达基因的筛选、克隆和测序：应用mRNA差异显示（DDRT －PCR ）、 PAGE 电泳、银染和反式Northern 点杂交的技术对响应声