枯草芽孢杆菌b-91菌株木聚糖酶的分离纯化及其酶学性质和免疫原性研究.pdfVIP

枯草芽孢杆菌BE．91菌株木聚糖酶的分离纯化 及其酶学性质和免疫原性研究 摘要 本研究旨在优化枯草芽孢杆菌BE．91菌株木聚糖酶活力测定体 系，提高酶活力测定方法的灵敏度和准确性；建立一套高效、快速分 离纯化方法，获得电泳纯木聚糖酶样品；获得一套较全面的木聚糖酶 酶学参数，测定和分析蛋白质氨基酸序列、二级结构以及与其他种属 木聚糖酶的亲缘关系；探索木聚糖酶的免疫原性，为枯草芽孢杆菌 BE．91菌株木聚糖酶的工业化生产应用提供理论依据。 1．采用单因素试验和正交试验对枯草芽孢杆菌BE一9l菌株木聚 糖酶活力测定条件进行系统研究，获得优化的木聚糖酶活力测定条件 为：按1／9的比值添加稀释loo倍的木聚糖酶与预热至62℃的浓度为 mol·L。1柠檬酸．柠檬酸钠缓 O．8％的木聚糖底物(用pH值5．4～5．6、O．05 mL 冲溶液配制)，62℃水浴准确反应3min，加入2．ODNS溶液，沸 水浴显色lOmin，测定波长为540nm。在此优化条件下，测得枯草 U．mL-1。 芽孢杆菌BE一91菌株木聚糖酶活力达350．24 2．对枯草芽孢杆菌BE一91菌株进行发酵培养，通过超声波破碎 U．mL一。采用 法证实木聚糖酶主要集中在胞外，测得发酵液酶活408 超滤和葡聚糖凝胶层析从发酵液中分离纯化出电泳纯木聚糖酶样品， 回收率高达69．17％，纯化倍数18倍，比酶活达到28453．6 U．m分1。 3．利用纯化的BE．91木聚糖酶进行酶学性质研究，采用SDS．PAGE kD、22．3l 和凝胶层析测得分子量分别为22．54 kD；IEF．PAGE测得 等电点为9．63；以燕麦木聚糖为底物时，砌值和‰似分别为O．5 4．6～6．4；Fe2+、C02+有 mg·n儿一、533U；稳定温度O～60℃；稳定pH 激活作用，Cu2+有强烈抑制作用。 张匿作：猫苹芽孢}于麓BE．9l菌株本聚糖酶的分离缝化硬j(酶学僻暖和免疫啜弹研究 4．对枯草芽孢杆菌BE．91菌株木聚糖酶电泳纯样品进行 比对推测出木聚糖酶的氨基酸全序列，与刘正初在Genebank登录的 木聚糖酶基因(登录号为EU233656)的氨基酸序列一致。通过生物信 果显示该木聚糖酶属分泌型、水溶性、跨膜蛋白；假定包括有2~4个 0【．螺旋，12～14个p．折叠，18个p．转角，1个的疏水结构域，8个亲 水结构域，和8个抗原决定簇；对全序列进行GENOME比对，建立 系统演化关系，结果显示与芽孢杆菌亲缘关系较近，且比较保守。 5．利用纯化的BE．91菌株木聚糖酶免疫SPF小鼠，收集血清样 品，以建立的ELISA方法检测血清样品中IgG水平、M吖和IL．4 含量，利用SPSS软件对结果进行分析。结果显示，试验组IgG水平 组与阴性组无显著性差异p0．05)；试验组烈F吖含量26．47pg．mL～， 与阴性组、空白组和阳性组有极显著性差异衅O．01)，阳性组与阴性 组、空白组有极显著性差异衅O．01)，空白组与阴性组无显著性差异 pO．05)；试验组IL．4含量52．53 pg．mL-1，与阳性组无显著性差异 pO．05)，与阴性组、空白组有极显著差异(氏O．01)，空白组与阴性组 Blot验证出清晰的目的条带，证明获 无显著性差异胗O．05)。Wrestem 得的多克隆抗体是针对枯草芽孢杆菌BE．9l菌株木聚糖酶的特异性 抗体。结果证明BE．91菌株分泌的木聚糖酶具有良好的免疫原性和反 应原性，能促进机体的细胞免疫反应和体液免疫反应。 关键词：枯草芽孢杆菌BE．