牛支原体pcr断方法的建立及流行病学调查.pdfVIP

摘 要 本试验在参考国外文献的基础上，设计引物，优化反应体系、条件，建立了牛 支原体巢式 PCR 、多重PCR 检测方法，应用 2 种检测方法结合病原学、血清学方 法对我国牛支原体感染和发病情况进行了流行病学调查，为我国牛支原体病的检测 和流行病学研究提供参考。 根据牛支原体的oppD/F 基因，设计第2 对引物，第 1 对引物参照国外文献记 载，通过优化体系、条件，建立了巢式PCR 检测方法：特异性试验证明未扩增出 丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体条带，只扩增出牛支原体特异性条带；敏 -7 3 感性试验证明扩增DNA 最低浓度为10 μg/mL ，敏感性较普通PCR 方法提高了 10 倍；用该方法对28 份牛支原体阳性病料进行检测，均扩增出牛支原体特异性片段。 根据牛支原体oppD/F 基因、丝状支原体丝状亚种小克隆p72 基因设计2 对特 异性引物，无乳支原体引物引自国外文献，建立了可一次性鉴别3 种支原体的多重 PCR 检测方法：特异性试验证明，可同时扩增出 3 种支原体的特异性片段，在优 化体系和条件下证明各模板和引物之间相互不构成干扰，未扩增出猪、鸡支原体模 板特异性片段；敏感型试验可检测到模板DNA 的含量为0.8μg/mL，多重PCR 的 2 敏感性较单一PCR 降低了10 倍；36 份临床样品检测结果显示，多重PCR 检测结 果与分离鉴定方法一致。 对 14 省市流行病学调查显示，血清学检测结果表明，84.4% 的场群存在抗体阳 性牛，平均个体阳性率为47.8% ，其中肉牛（52% ）和奶牛（61.2% ）个体阳性率较 高，而牦牛个体阳性率（14.2% ）较低；从 178 份组织样品（肺脏、关节液和鼻拭 子）中共分离鉴定出 18 株牛支原体。 关键词：牛支原体；巢氏PCR ；多重PCR ；流行病学调查 Establishment of the PCR method for detecting mycoplasma bovis and Epidemiological survey of Mycoplasma bovis disease Abstract Nested PCR and multiple PCR detection method is established on the basis of reference to the foreign References through primers were designed. Situation of M.bovis infection and illness were surveyed application two detection method combined etiology and serology method.These experiments provided the reference for our laboratory testing and prevention of the disease. The nested PCR was established through optimizing system and conditions and the first pair of primers refer to foreign references,the second of pair primers were designed according to M.bovis oppD/F gene.The special test showed that no fragment while detecting M.mycoides subsp mycoides small Colony Type,M.agalactiae.Result of sencitivity showed the