禽呼肠孤病毒s、s4基因的克隆与序列分析.pdfVIP

摘 要 参考GenBank 中禽呼肠孤病毒176 株（ARV 176 ）S2 和S4 基因分别设计两对 引物，对禽呼肠孤病毒内蒙古地区分离株C-98 和天津地区分离株T-98 分别进行总 RNA 的提取，以其为模板，应用RT-PCR 方法扩增病毒S2 和S4 基因的cDNA 片段， 将纯化的S2 和S4 基因的cDNA 片段克隆到pEASY-T1 载体，转化DH5α 感受态细 胞，应用蓝白斑法筛选阳性重组质粒，通过PCR 法鉴定重组质粒，然后将PCR 鉴 定为阳性的重组质粒进行测定基因序列。测序结果表明：S2 基因全长为 1324bp， 含有一个完整的开放阅读框，位于16bp～1266bp，编码416 个氨基酸组成的 σA 蛋 白。S4 基因全长为 1192bp，含有1 个完整的开放性阅读框，位于24bp～1127bp， 编码由 367 个氨基酸组成的 σNS 蛋白。并已将测得的序列成功登录 GenBank， ARV C-98 S2 基因登录号JN641886 ；S4 基因JN641885 ）；ARV T-98 S2 基因登录号 JN641887；S4 基因JN641884 。 基因序列及其推导的氨基酸序列同源性分析表明：ARV C-98 和ARV T-98 分离 株的S2 基因与参考毒株ARV 176 、ARV 918 、ARV 919 、ARV 1733 、ARV GX2010 、 ARV S1133 和DRV YJL S2 基因的核苷酸同源性最高，在99.2%～99.8%之间；推导 的氨基酸的同源性在98.1%～99.8%之间；与参考毒株MRV 3 、MRV 3-jin -1 和MRV 3-T3D S2 基因的核苷酸同源性在2.4%～5.5%之间；推导的氨基酸序列同源性却在 29.1%～29.3%之间。ARV C-98 和ARV T-98 分离株的S4 基因与参考毒株ARV 176 、 ARV 601SI 、ARV 919 、ARV 1733 、ARV GX2010 、ARV S1133 和DRV YJL S4 基因 的核苷酸同源性较高，在 99.0%～99.8%之间，推导的氨基酸的同源性在 98.9%～ 100.0%之间；而与参考毒株MRV 3 、MRV 3-jin -1 和MRV 3-T3D S4 基因的核苷酸 同源性都为 2.4% ；推导的氨基酸序列同源性在3.6%～9.0%之间。遗传进化树分析 显示：17 株禽源呼肠孤病毒分离株的S2 基因可分出3 个不同的谱系，S4 基因可分 出4 个不同的谱系，并且ARV C-98 和ARV T-98 与禽呼肠孤病毒株ARV 176 、ARV S1133、ARV 1733 、ARV 919 、ARV GX2010 和DRV YJL 的S2 基因S4 基因始终 在遗传进化树的同一个谱系中，且ARV C-98 和ARV T-98 与禽呼肠孤病毒株ARV 176、ARV S1133 、ARV 1733 、ARV 919 、ARV GX2010 和DRV YJL 遗传关系最近。 证明了各谱系之间和同一个谱系之间的各个毒株的亲缘关系与致病性、毒力强弱和 分离地区，分离时间没有相关性。 关键词：禽呼肠孤病毒；S2 基因；S4 基因；RT-PCR ；克隆；序列分析 Cloning and Sequence Analysis of the S2、S4 Gene Of Avian Reovirus Abstract According to the S2 and S4 gene sequence of Avian reovirus strain176(ARV 176) published in GenBank,two pairs of primers were synthesized.The total RNA of ARV isolate T-98and C-98 isolated in Tianjin and inner Mongolia were extracted.The S2 and S4 gene of virus was amplificated by RT-PCR