禽流感病毒m1体和ns1抗体间接阻断elisa检测方法的建立及比较.pdfVIP

摘 要 摘 要 禽流感（Avian Influenza ）是由A 型流感病毒引起的一种禽类的感染和/或疾病综合征。 其中高致病性禽流感(HPAI)是近几年来在许多国家流行、给养殖业带来巨大经济损失、并且 威胁到人类健康的一种烈性传染病。AIV 的快速检测技术是有效控制AI 流行的检测手段和 重要前提，因此我们进行了本研究。 M1 蛋白是流感病毒的型特异性蛋白，是流感病毒分型的主要依据，并且在A 型流感病 毒的进化过程中具有变异缓慢、高度保守性的特点，因此可以作为检测抗原来诊断各亚型 AIV 。 NS1 蛋白是流感病毒的非结构蛋白，具有高度的保守性，在病毒复制的早期就大量表达， 仅出现于被病毒感染的细胞内，并且能诱导机体产生NS1 抗体。因此NS1 蛋白可作为一种 检测抗原，通过检测NS1 抗体来区分野毒感染和疫苗免疫的禽群。 本研究利用重组AIV M1 蛋白和NS1 蛋白作为检测抗原，相应蛋白免疫家兔获得的阳性 血清作为阻断抗体，分别建立了M1 间接阻断ELISA 和NS1 间接阻断ELISA 。M1 间接阻断 ELISA 的工作条件为：M1 最佳包被浓度为0.78µg/mL ，阻断抗体最佳稀释度为1:15 000，待 检血清最佳稀释度为1:10，羊抗兔酶标二抗工作浓度为1:15 000；NS1 间接阻断ELISA 的工 作条件为：NS1 最佳包被浓度为0.6 µg/mL ，阻断抗体最佳稀释度为1:10000，待检血清最佳 稀释度为 1:10，羊抗兔酶标二抗工作浓度为1:15 000。 （1）M1 阻断ELISA ：对38 份禽类阳性和26 份禽类阴性样本的检测结果表明，本方法 的敏感性为97.37%，特异性为96.16% 。交叉反应试验证明本方法与NDV 等8 种其它禽病阳 性血清不发生交叉反应。对268 份临床样品进行检测，结果表明M1 阻断ELISA 与HI 试验 的符合率可达92% 以上。（2 ）NS1 阻断ELISA ：对42 份禽类感染血清和50 份灭活疫苗免疫 禽血清的检测结果表明，本方法的敏感性为 95.2%，特异性为90.0% 。交叉反应试验证明本 方法与NDV 等8 种其它禽病阳性血清不发生交叉反应。临床检测结果表明，对 186 份灭活 疫苗免疫禽血清、20 份基因工程疫苗免疫血清和 42 份健康非免疫禽血清样本的阴性率为 89.2%、95%和 100%。（3 ）M1 间接阻断ELISA 和NS1 间接阻断ELISA 的比较：检测感染 血清时，M1 间接阻断ELISA 敏感性更高，在检测健康非免疫禽时，NS1 间接阻断ELISA 特 异性更高。 研究表明：这两种方法均可不受动物种属和禽流感血清亚型约束，一次性检测多种属动 物不同血清亚型抗体水平。其中M1 间接阻断ELISA 可以为免疫家禽血清中生成抗体水平的 检测提供有效的定量依据，更可以为判断非免疫养殖禽类、野生禽类是否感染禽流感病毒提 供了快速可靠的实验室检测方法。而NS1 间接阻断ELISA 则可以根据NS1 抗体水平来区分 自然感染禽群和疫苗免疫禽群，以此作为早期感染的依据。临床应用中，两种方法配合使用 可以进一步区分禽流感自然感染、灭活苗免疫和健康非免疫禽群，为净化禽群提供了一种切 实可行的血清学诊断方法。 关键词 禽流感；M1 蛋白；NS1 蛋白；间接阻断ELISA I Abstract Comparison and Establishment of an Indirect-blocking ELISA for Detection of Antibodies Against Protein M1 and NS1 of AIV Abstract Avian Influenza(AI) is an infectious and/or diseas