蚓激酶重组逆转病毒载体的构建.pdfVIP

摘 要 血管疾病的预防和治疗。目前临床应用的LK均是从蚯蚓体内直接提取，其制各工艺 繁杂，产量较低，因而通过基因工程手段生产大量高纯度的LK己成为一种极有前景 的途径。本试验在之前工作基础上构建了含有蚓激酶基因的重组逆转录病毒载体，然 后以牛体做为生物反应器，在牛奶中瞬时表达蚓激酶，以期验证载体构建的合理性， 为最终获得转基因奶牛等乳腺生物反应器提供一定的理论和实验依据。 将质粒转染泌乳期奶牛乳腺小叶，收集不同时段奶样，采用纤维蛋门甲板溶圈法 (FibrinAgarose 启动子能指导目的基因即蚓激酶基因在奶牛乳腺组织实现有效瞬时表达，并且根据 FAPA法检测结果表明奶牛乳腺组织在注射重组质粒转染3h后，奶样即出现明显纤 准品制作标准曲线计算出最高表达量约为400(OUK／L牛奶。 将表达目的蛋白的奶样经SDS．PAGE凝胶电泳检测，结果显示：表达的蚓激酶 分子量约为40kDa。表明牛奶中有蚓激酶的瞬时表达，分子量比理论计算值稍大。可 能是其经糖基化等修饰的结果。由于现在没有获得针对蚓激酶的特异性抗体，所以未 能进行Westernblot检测。 关键词：蚓激酶：逆转录病毒：乳腺表达：FAPA；转基因 Abstract anew-antithrombotic been usedin Lumbrokinase(LK)，as medicine，haswidely prevention-and because treatmentofischaemiccerebrovasculardiseases ofits function．At is thrombolyticapresent,it extractedfromthe itisdifficultand to usually earthworms，and time-consumingpurify． to Inordersolvethese anowmethodtoobtain problems，wedeveloped Lumbrokinasemoansof by Recombinantretroviralvector LumbrokinasecDNAWasconstructed． gene吒ngineering． harboring was COW Lumbrokinase inthemilkof expressedtransiently mammary#ands． The B-casein andbovine expressioncassette，includinggoat promoter(BCP)，u(cDNAgrowth cloned to into constructtherecombinantretroviralvector hormone(BGH)polyA，WaspLNCL therecombinantinto pLN—BCP-LKa．Afterinjecting plasmidlactatingmammary#andsofcow,LKwas tohe shown inthemilk．The ofthemilkwas in“16