蜜蜂白垩病pc及荧光实时定量pcr诊断方法的建立.pdfVIP

蜜蜂白垩病PCR及荧光实时定量PCR检测方法的建立 摘要 蜜蜂白垩病(beechalkbrooddisease)是一种由蜜蜂球囊菌(AscosphaeraapiS)寄 生而引起蜜蜂幼虫死亡的真菌性传染病。蜜蜂球囊菌的孢子的抗逆性极强，其在花粉中 的存活期为1年，而在干燥条件下能够存活15年。该病传播的媒介广泛，污染的饲料与 蜂具等都是传播的主要媒介。群内传播主要是通过内勤蜂的饲喂活动，将花粉中的孢子 传染给健康幼虫而染病，此外，茵丝体也能直接侵染幼虫。白垩病在我国及世界各地都 有发生，而且在我国一些地区的蜂群中蜜蜂传染病近年呈爆发流行，是养蜂业发展的大 敌，严重影响着世界各国养蜂业的发展及蜂蜜的产量和质量。白垩病发病后很难控制， 染上白垩病的蜂群重则全群覆没，轻则群势渐弱。同时，由于病原体对蜂蜜的污染和发 病后的用药不当造成的兽药残留超标都严重地影响了蜂蜜的质量，近年来成为困扰蜂蜜 世界贸易最重要因素。目前国内外对白垩病的检测和防治，都没有标准的规范。因此， 白垩病的及时准确诊断对于该病的防治极为重要，只有及时诊断、合理用药才能有效防 治白垩病和尽量避免用药在蜂蜜中造成残留。 随着PCR技术的发展，人们在利用PCR技术进行定量研究方面进行了一系列有意义 的探索。现在PCR等分子生物学检测技术在人和动物传染病诊断方面已广泛应用，在蜂 病的诊断研究方面在国外也已有一些研究报道，但在国内还没有这方面的研究报道。PCR 检测方法具有快速、敏感性高、特异性强等优点，可用于快速诊断蜜蜂传染病，尤其对 于病毒病及多种病原引起的混合感染的鉴别诊断更为有效。蜂病的发生不仅影响蜂蜜的 产量，而且病原又会进一步污染蜂蜜，从而严重影响蜂蜜质量，影响出口。PCR方法还 可直接用于蜂产品中这些病原污染的快速检测。通过研制PCR及荧光定量PCR方法可对 蜜蜂传染病作出快速准确诊断，正确指导用药，做到早诊断，早治疗，避免盲目用药造 成兽药残留超标。 transcribed ribosomalRNA internalWanscribed l，5．8S 2．)序列，利用 spacer gene，and spacer 本研究通过系列试验优化建立了PCR最佳反应条件和最佳反应体系，并通过敏感性试验、 特异性试验和重复性试验表明所建立的PCR方法具有良好的敏感性、特异性和稳定性。 建立的PCR方法可以检测到7CFU／ml的病原样品，整个试验操作过程5个小时，较常规 临床诊断或ELISA诊断方法提高了敏感性且缩短了诊断时间，做到能够快速、准确检测 出蜜蜂白垩病病原菌。 V 建立了检测白垩病原蜜蜂球囊菌DNA的荧光实时定量PCR方法。根据已发表的蜜 本试验应用的引物、探针可扩增lng的蜜蜂球囊菌DNA样品，检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌、 蜂房蜜蜂球菌、蜜蜂败血杆菌呈阴性，说明本研究建立的荧光实时定量PCR高度敏感、 特异性；本试验所用的仪器为ABI7000，可同时检测96份样品，并实时监测反应系统 内荧光强度的改变情况，又因不用电泳，大大减少PCR产物污染，因此本试验建立的 方法即具有高通量性，可用于大量样品的长期检测而不产生PCR产物污染，提高了方 法的特异性，还具有快速检测的特点，一般在4小时内作出检测结果。如果发生假阳性， 可很快用备份样品实行快速检测进行纠正，作出比常规PCR更客观的试验结果，更客观 判定阳性、阴性和可疑。重复性试验证明本试验建立的方法稳定，出具的结果有一定的 可信度，可应用于实践白垩病检测。 关键词：白垩病．PCR．荧光PCR．检测 Ⅵ APCR DetectionMethods andReal-time Quantitative-PCR Fluorogenic ChalkbroodDisease for IdentificationofBee