蜡样芽孢杆菌（acillus cereus）β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的克隆与表达.pdfVIP

中文摘要 本研究旨在采用分子生物学技术，构建一种具有较高耐热性的B 1，3 —1，4～葡聚糖酶基因工程菌，利用其产生的酶制剂来提高大麦在饲料业和 酿酒业中的应用价值。 试验以筛选得到的具有较高耐热性的菌株…蜡样芽孢杆菌(BaciJlus —1，4一葡聚糖酶基因序列，分析其同源性，并根据其保守区设计2对引物， 的5，端和3，端基因片断，测序结果表明，其长度分别为461bp和636bp。 以克隆得到的5’端和3’端基因片断作为混合模板，以5PAl和3PA2为 extension，又叫重叠延伸剪接术) byoverlap 引物，应用SOE技术(splicing 上所登录的水解淀粉芽孢杆菌(B (B．s“btilis)、地衣芽孢杆菌(B 1，4一葡聚糖酶基因具有较高的同源性，同源性分别达90％、98％、82％ 和85％。其CDS(Coding 基酸。同源性比较结果显示其所编码的氨基酸与上述四种微生物所编码的氨 基酸之间存在相当大的保守区域。初步认定，这些保守区域可能与B一1，3 —1，4一葡聚糖酶的功能有关。 coli ’BL一2产菌株为宿主菌)，将已克隆的B—l，3～l，4～葡聚糖酶基因片段F1 进行表达。表达的具体过程如下：首先根据表达载体以及全长基因F1的基 T-Vector连 和3PA4为引物克隆得到基因片断F2；将F2与克隆载体pOEM 接，经NcoI和Xhol双酶切后得到的全长片断F3与经双酶切的表达载体 tlC菌株。 阳性表达子，即为所得到的新型基因工程菌，命名为￡coli 111 叵coil A一50层析柱分离纯化。将纯化得到的B—l，3一l， G一25和DEAE—Sephadex 4一葡聚糖酶进行酶学特性分析。结果显示，其最适反应温度为60℃，在50 ．C以下较为稳定；最适反应pH值为8．0，最适贮存pH值为4．5，与出发菌 l，4一葡聚糖酶的分子量约为22．9kD。 上述结果表明，蜡样芽孢杆菌BacigJus 聚糖酶基因已经被成功地克隆和表达，从而为进～步构建耐热的B一1，3一l， 4一葡聚糖酶基因工程菌奠定了基础。1 BacilJus 关键词： CQ2一SLISi B一1，3一l，4一葡聚糖酶；基因 克隆； 表达；基因工程菌 The and of expression cloning cereus Bacillus from gene encoding Candidate：Zhao Huacheng Sun Advisor：Professor Jianyi Xu Professor