传染性胃肠炎病基因组大片段克隆及其主要抗原片段在伪狂犬病病毒中的表达.pdf

摘 要 传染性胃肠炎病毒属于冠状病毒科，主要引起猪的肠炎和严重的腹泻，新生仔 猪的感染将导致严重的的死亡，给养猪业造成了巨大的危害和经济损失。TGEV基因 kb，5 组为单股正链RNA，具有感染性，全长约28．57端20kb序列编码病毒的复制 酶多聚蛋白，37端约8．3kb编码4种结构蛋白(S、sM、M、N)和4种非结构蛋白， 这些蛋白在病毒的生活周期中都具有重要的作用。其中S蛋白具有重要的生物学功 能：携带有主要的B淋巴细胞抗原决定簇，是唯一能诱导机体产生中和抗体和提供 免疫保护作用的结构蛋白；含有宿主细胞氨肽酶的受体识别位点，决定其宿主组织细 胞亲嗜性；是决定TGEV的毒力的基因之一；具有细胞膜融合作用，协助病毒从细 胞核蛋白进入细胞浆；具有血凝活性区。目前，TGEV部分基因的功能还不完全清楚， 片段eDNA，为后期进行感染性克隆、基因功能研究、致病机制和疫苗的开发打下坚 实的基础，也为冠状病毒特别SARS等的研究提供参考。 3’ eDNA片段，经生物信息学软件拼接共获得了TGEV 1427bp、132Top的TGEV 8495bp的序列。基于TGEV 6片段PCR产物，其 个片段，分别命名为pTA—A、pTA—B、pGM-T。 为了在原核细胞和真核细胞中进行S基因主要抗原片段的表达，设计一对引物从 在Ecoli 表达。 为了构建表达TGEVS基因主要抗原片段的PRV重组病毒，PCR扩增了s基因主 要抗原片段，并克隆到已经构建成功的绿色荧光蛋白转移载体pPPl2．EGFP中，命名 细胞，结果在12小时以后可以观察到绿色荧光，24～48小时荧光到达最大量，48 小时后荧光开始衰退，细胞在转染48小时后开始出现病变，96小时后细胞75％出现 病变；在96小时后可以看见出现发生重组的绿色荧光病变细胞，挑取病灶反复纯化 几次，获得了表达s基因主要抗原片断重组病毒PRVSA215-S，抽提病毒基因组DNA， PCR扩增能够从中扩增出大小为1．7kb的S基因主要抗原片段。 应用生物信息学软件分析了PRY和TGEV全基医序列的密码子偏爱性，分别计算 散点图、对应分析解析了TGEV和PRV密码子用法发生偏爱的主要影响因素，结果表 的密码子，影响PRV密码子偏爱G、C的主要因素是碱基组成限制、碱基突变、翻译 选择和基因功能，TGEV的影响因素则只有碱基组成限制、碱基突变，翻译选择对其 密码子的用法无影响。 关键词：传染性胃肠炎病毒； eDNA克隆；重组病毒；表达； 密码子偏爱性 II Abstract eDNAcloneoftransmissible virus and genome gastroenteritis ofthe of in expressionmajorantigensspikeprotein virus pseudorabies Yin Huaping(PreventiveVeterinary) DirectedGuoWanzhu by ofthe T