利用multile-primerpcr对种公牛进行个体识别方法的建立.pdfVIP

摘 要 运用种公牛精液基因组中的分子标记进行个体识别可以判断被检样本与目标样本是否一致。本 论文选取来源不同的 50 支种公牛细管精液，采用正交实验法优化了种公牛精液 DNA 的提取方法， 建立了 multiple-primer PCR 的反应最佳体系，并分析了可用于个体识别的29 对微卫星标记，筛选出 11 对检测效果良好的引物，建立了利用微卫星的个体识别方法。 试验一、 采用正交实验法优化试剂比例，调整 PH 值、渗透压和离子浓度等参数，建立了种公 牛精液 DNA 的快速提取方法，即在细管精液加入 1mL 的消化液，其成分：Tris 50 mmol、EDTA 10 mmol 、蛋白酶K 100 mg/L 、DTT 10 g/L 、NaCl 9 g/L 、urea 1 mol/L 和 SDS 2 %。混匀后，于58℃消 化 1 h， 97 ℃灭活蛋白酶 K 10 min ，再用苯酚-氯仿方法抽提，可得到高质量的 DNA ，OD260/OD280 为 1.84 左右。 试验二 、通过调节 PCR 增强剂比例和 PH 值对 Taq 酶反应环境进行优化，同时对 PCR 基本成 分（Taq 酶、MgCl2 和 dNTP 等）进行调整。利用排列组合方法排除干扰引物，筛选出 Multiple-PCR 反应的最佳体系，即 PH=9.7 的 10 ×buffer （Tris-HCl 100 mmol 和 KCl 500 mmol) 2.5 uL ，Taq 酶 10 U ，DDT 为 8 mmol，dNTP 为 0.8 mmol，甘油 5 %，二甲亚砜 0.25 %和甲酰胺 0.5 %，DNA 模板 100 ng ，上下游引物除 MM12 为 0.26 μL 外，其余均为 0.13 μL ，最后加水至 25 μL 。反应程序为 95 ℃预变性 5 min，94℃变性 30 S，退火使用touch-down 方式，温度范围为 65-61℃，时间为40 S ，72 ℃延伸45 S ，从第2 步到第 5 步 10 个循环，94℃变性 30 S，61℃退火40 S ，72℃延伸45 S ，从第 6 步到第 8 步 25 个循环，65℃延伸 1 h，25 ℃延伸 1 h，4 ℃保存。通过建立的方法对 16 个种公牛样本 进行验证效果良好。 本研究摸索出从种公牛精液快速提取高质量 DNA 的方法，通过构建 multiple-primer PCR 的反应 体系和反应程序，同时扩增了 11 对引物，并对检测样本进行检测验证取得较好效果。本研究以精液 为检材提高了种公牛个体识别的工作效率，为家畜个体识别研究奠定了理论基础与实验技术。 关键词：种公牛；个体识别；多引物 PCR ；微卫星 论文类型：B （应用基础研究） I Abstract It is one of methods to improve Animal population genetic performance using molecular mark of bovine semen. The study found out rapid extraction method of cattle semen DNA and constructed multiple-primer PCR system by orthogonal experimental method. 11 of 29 primers were screened to be used for personal identification, and the way of individual identification with microsatellites. 1 Orthogonal experimental method was used to the reagents proportion. Suitable PH value, osmotic pressure and the concentration of the io