柔嫩艾美耳球虫子化卵囊和子孢子差异表达基因的研究.pdf

摘 要 鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于肠道所引起的一种危害严重的全球性寄生虫病，给养鸡业造 成巨大的经济损失。目前控制球虫病的主要方法包括化学药物防治和疫苗免疫预防，但由于这些 方法存在安全、价格以及抗药虫株出现等问题，迫切需要寻找新的防治手段来控制球虫病。而研 制高效安全的抗球虫病基因工程疫苗和新药物的关键在于寻找到重要的虫体抗原基因。本论文以 对鸡危害最为严重的柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)为研究对象，开展了Etenella孢子生殖 发育阶段差异表达基因的分离、鉴定等研究，为探讨鸡球虫的入侵和生长发育机制，研制高效、 安全的抗球虫疫苗和新药物奠定了重要基础。 1．利用抑制性消减杂交技术和eDNA微阵列技术筛选Etendla孢子化卵囊和子孢子阶段虫体差 异表达基因 为了分离鉴定Etenella孢子发育阶段虫体的差异表达基因，分别以Etenella未孢子化卵囊 和孢子化卵囊为驱动组，子孢子为实验组；未孢子化卵囊为驱动组，孢子化卵囊为实验组，利用 抑制性消减杂交(SSH)技术，构建了1个E 1个子孢子与未孢子化卵囊的消减eDNA文库(zw)和1个孢子化卵囊与未孢子化卵囊的消减 减eDNA文库的重组率为98％，大部分插入片段都大于500 bp。从构建好的3个消减eDNA文库 中共挑取3004个克隆制成eDNA微阵列。芯片杂交分析后获得1371个差异表达基因克隆，其中 孢子化卵囊31个，子孢子87个。序列同源性搜索结果显示：31个孢子化卵囊单一基因中，蛋白 功能已知的有12个，蛋白功能未知的有19个，在球虫中已报道的有7个；87个子孢子单一基因 中，蛋白功能已知的有23个，蛋白功能未知的有64个，在球虫中已报道的有6个。从中选择了 5个差异表达基因克隆，应用实时定量PCR进行验证，结果显示与芯片杂交结果一致。BLASTX 同源性比较分析后发现：孢子化卵囊阶段虫体差异表达基因编码的蛋白与Etenella微线蛋白、 1．A4抗原蛋白、表面抗原蛋白，刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)的热激蛋白和蛋白质二硫异构 tenella SERPINI蛋白、微线蛋白、 蛋白激酶，约氏疟原虫(Plasmodiumyoelii)神经磷脂酶C，E 反转录酶等有较高的同源性。提示这些基因编码的蛋白可能参与了卵囊孢子化的形成、虫体的入 侵、虫体在宿主细胞内的生长发育、虫体与宿主细胞的相互作用、细胞代谢、免疫调节及细胞信 号传导等。本研究为分析鉴定鸡球虫孢子发育阶段虫体差异表达基因，探讨与鸡球虫入侵和生长 发育相关基因的作用机制等奠定了基础。 II z晟tene／／a孢子化卵囊和子孢子差异表达新基因全长eDNA的克隆与分析 根据差异表达基因的ESTs序列，利用RACE技术扩增获得8个Etenella新基因的全长cDNA， 孢子新基因全长cDNAs(编号为：ZBI-A02、ZBl-A08、ZBI 原位点等进行了分析预测，对编码蛋白的保守功能域、结构位点及同源性蛋白进行了搜索，结果 显示4个基因编码的蛋白与其它顶复器原虫蛋白有较高的同源性，其中孢子化卵囊高表达基因 BWll-H07编码的蛋白与z z PDI-like gondii蛋白质二硫键异构酶(putativeprotein)有较高的同源性；子孢子阶段高表达基 因编码的蛋白与婴儿利氏曼原虫(Leishmania infantum)蛋白激酶有较高的同源性；其余基因编 码的蛋白可能是最tenella特有的蛋白。本研究为鸡球虫候选基因工程疫苗靶分子和新治疗药物靶 标的筛选提供了重要的参考依据。 3．E tenella新基因在大肠杆菌中的表达 将获得的E 其中4T-E06表达的融合蛋白大部分以可溶性蛋白形式出现，其余3个重组质粒表达的融合蛋白都 以包涵体形式存在，利用GST 个重组蛋白都具良好的抗原性。进一步深入研究这些基因以及编码蛋白的功能，对研制鸡球虫候 选疫苗和新治疗药物都具有重要意义。 4．Etenella重组蛋白免疫保护