柠条锦鸡儿苯丙酸解氨酶（pal）基因的克隆、rnai载体构建和相关功能分析.pdf

摘 要 柠条锦鸡儿抗干旱、高温、寒冷，耐盐碱和贫瘠土壤，是我国西部等环境极端地区的重要栽 培灌木品种和重要的饲料、制浆树种。但柠条的木质素含量较高，降低了柠条的饲用价值，增加 了柠条纸浆开发的成本。因此进行柠条木质素生物合成调控方面的研究意义重大。 本论文以柠条锦鸡儿为实验材料，以木质素合成关键酶PAL为对象，进行了酶的纯化、酶活 性的时空差异、编码基因的时空表达、编码基因片段的克隆、RNAi载体构建及RNAi序列对靶酶 的调控效应等方面的研究工作。 实验结果表明：柠条干种子中存在微弱的PAL活性，当种子开始萌动后PAL活性迅速增加， 活性比干种子增加近4倍，比活增加5倍多。从萌芽期到硬化期，在实验样品的根、茎、叶及相 应器官中PAL活性和比活均呈现出小一大一小的类抛物线变化。叶器官中PAL活性从子叶期到速 生期迅速增加，真叶期比子叶期增加2．2倍，速生期达到最大，比真叶期增加1．33倍。而硬化期 活性降低，硬化期比速生期活性降低21％；茎中PAL活性从子叶期到速生期迅速增加，真叶期比 子叶期增加1．48倍，速生期达到最大，比真叶期增加1．25倍。硬化期时活性大大降低，仅为速 生期活性的48％；而根中PAL活性在真叶期达到最大，真叶期后活性降低，速生期、硬化期的活 性分别为真叶期活性的49％和17％。各器官中PAL比活变化与活性变化基本相似。 速生期叶片中的PAL，经DEAE52离子交换层析分离，可以得到2个活性峰，分别在盐离子浓 得到1个活性峰，在盐离子浓度约为o．“时出现。分子筛层析表明：DEAE52中分离到的活性峰 均为单一活性峰组分，0．4M盐离子洗脱峰分子量约为222l(D；O．75M盐离子洗脱峰分子量约为 82KD。 阶段，册J有不同的表达量。柠条存在2类加』编码基因，碱基数较少的b基因存在于所有样本 中，而碱基数较多的a基因仅存在于叶片中。根部器官中册m基因的表达以子叶期为最高，分别 约为真叶期、速生期和硬化期的1．24、1．94和5．17倍。茎中该基因以真叶期为最高，分别约为 子叶期、速生期和硬化期的2．85、4．6l和5．11倍。叶中该基因以真叶期为最高，分别约为子叶 与b基因相似，以真叶期为最高，分别是子叶期、速生期和硬化期的2．82、1．93和2．38倍；但 (1)a基因表达量差异比器官中b基因问的差异小；(2)a基因的表达量比同期b基因的表达量 低，a基因的表达量与同期册』总表达量的比值随发育而升高。 对用TRIz0L法提取的真叶期、速生期、硬化期茎的RNA，进行了质量分析，结果表明：所 提RNA样品中0D2。o／ODm均超过1．9；在电泳条带上28s／18s均超过2。 根据以DNA为模板扩增出的叩I序列设计一对特异引物，以册』表达量最高的真叶期茎刚A i蓁鼍； 彗蕾gS蔓荽墓鎏至羹耋l差；幕蠹茧忤誊：社羹誊蹩毒罩鲁蓍量j享；!i；雕琴}；≮；11n哩P；}薹g翌二：#≯；童PI；iii{≤}i 豢*，，i。豢≈，。”酮酮强；}囊j翮基睦i嚣g彳j 趔；自ii}；??摩：i§§§≤；：≤{；；!；；女ll—iF；÷ iI芎! 至重；{÷÷ii÷；萋霎雏：量囊萄il强等t’≤珥i羞j i孽墨{ 乒l摄iii，塞舅唁i j妻蠹舅j墨i毫ll{毫j善；亭性￡l塞ii§善aigj‘妻÷j自l!型妻}j引!d醢≥i^坚坚E㈣k目目=a日i 誊i：ijl壁；誊蠢茎鲁女÷i|重薹，t鼍÷于≥掌～霉耋鬟。 !；夏； 善￥i沿；X：jiif}}塾婺；委H型《!善!i《l￥i：=i；j童i；毫垂蓬：萼如《萋iql羁囊重==；；i覃窖窖j姜i!萋； ；再4i ；喜主三妻羞盘了fll!至若蓄i等l；i彗童!毒i重i薹譬蠢i；}譬参参i荤i钉并!；；}；j化量妻善年i呈季i譬耄；ii，蓉j{Ijl帅ij董董；i￡l爱；窖j孽霉霉i lH!j ；i喜! ；蠢参； ；蚕蓖i j彝1} ofTRIZOL extractedtheRNAof Byusing method，we Ca，口g口n口置。rs^fns足ff withthe of 足口m．indifferent didthenorthefnblo