番茄cf-4和f-9基因介导的过敏性反应调控及基因沉默技术的研究.pdf

浙江大学博士论文 摘 要 基因对基因抗性是植物抗病性的重要表现形式。该抗性由植物抗病基因 (resistancegene，R)和互补病原物无毒基因(avirulence gene，Avr)共同决定。R 与Avr的互作通常导致过敏性坏死(hypersensitiveresponse，HR)。番茄 (Lycopersicon 基因抗性的模式系统。该系统中多对R／Avr互补基因对，包括Cf-4／Avr4和 Cf-9／Avr9，已被克隆。本论文研究内容包括两部分。第一部分，以番茄与叶霉菌 thaliana) 的HR的影响。第二部分，应用于模式植物番茄和拟南芥(Arabidopsis induced 的病毒诱导的基因沉默(virus gene silencing，VIGS)操作体系的优化和 开发。所获主要结果如下： 1．明确了cf4和cf9基因启动予转录调节活性的差异。构建了cf-4和cf-9 基因上游3 f]uolescence (green 35S启动子驱动的嵌合结构35S：：GFP。 pCf4：：GFP和pCf4：：GFP，以及由CaMV 通过遗传转化，获取了上述五个结构的转基因烟草。将pCf4：：Cf9和pCf9：：Cfi9 基因对。这些Cf-9／Avr9烟草在25。C萌发后迅速产生HR，最终死亡。通过比较 其对发育的影响，和对温度的敏感性等方面均有显著差异。在25。C培养时， pCfg：：cf-9／Avr9烙草种子萌发后不脱种皮，子叶很小且不能正常展开，整苗鲜重 生均受到抑制，两种烟草苗的发育情况以及最终表现HR和死亡的时间均相似。 性高于pCf4，而且对高温更敏感。 浙江大学博士论文 与高湿协同抑制HR，导致HR完全不能产生。组织染色和HR标志基因表达分 析进一步证实了肉眼观察的结果。对60个与HR，信号传导和防卫反应相关基 因的转录本分布型(transcriptprofile)的研究发现，导致不能产生HR的高湿条 件与导致HR产生的正常湿度条件下，基因转录本分布型存在显著差异。表明高 湿对Cf／Avr介导的HR的抑制作用位点可能处于Cr下游信号途径中非常早的位 嚣上，或者是由于高湿抑制了cf和Avr的互作。 3．优化了TRV介导的拟南芥基因沉默操作体系。利用改进型TRV载体，对 农杆菌接种液浓度、农杆菌恢复培养时间、农杆菌接种方法，接种时植株生育期， 和接种后植株培养温度等因子对基因沉默效果的影响进行了比较研究。发现，生 育期对拟南芥的基因沉默效果影响较小。但其它四个因子与沉默效率密切相关。 通过对基因沉默效果相关因子的筛选，优化出一套能够在拟南芥上获得稳定、高 效基因沉默效果的方案。即采用20D浓度农杆菌，恢复培养2h，抽真空接种后 置于22--24C条件下培养，对拟南芥进行沉默。此外发现，在拟南芥7—8叶期 及以上生育期按种农杆菌时，不仅可以沉默叶片，而且可以沉默茎秆、花絮和果 荚内源基因。果荚完全白化的种子萌发后，并不表现白化表型。说明沉默效率不 能经种子遗传到下一代。 4．建立了番茄成株期以及花组织基因沉默操作体系。研究了中国番茄黄化曲 B 13介导的番茄基因沉默的特点。发现，DNAm 叶病毒(TYLCCNV—Y10)DNAm 不仅能诱发苗期番茄，而且也能诱发成株期番茄产生基因沉默。表现基因沉默的 组织不仅包括叶片、时柄、侧芽、幼茎，还包括番茄花器官的萼片组织。这是目 前首例有关利用VIGS沉默番茄花器官基因的报道。此外，DNAmB介导的基因 沉默对温度不敏感，20--26C范围内均能产生稳定的基因沉默。说明，DNAm§ 介导的基因沉默体系将可为研究番茄生长发育后期不同组织基因的克隆及功能 鉴定提供强有力的技术平台。 5．建立了茄科植物极小幼苗基因沉默操作体系。本研究