白僵菌硝酸盐还酶缺陷型突变体的筛选与鉴定.pdfVIP

白僵茵硝酸盐还原酶缺陷型突变体的筛选与鉴定 摘要 白僵菌是～种重要的虫生生防真菌，在害虫防治中有着广泛的应用，目前其菌种改良 的首选方法是基因工程育种，而筛选安全标记对获得工程菌的释放和推广有着重要意义。 构建白僵菌硝酸盐还原酶缺陷型突变体，以此为转化受体，通过硝酸盐为唯一氮源筛选转 化子，可以避免引入任何外源筛选标记，使转基因生物更安全。 本研究采用两种诱变方法获得白僵菌不利用硝酸盐突变体，分别为甲基磺酸乙酯 生质体通过富集培养后获得突变体149株；149株突变体经过氮源筛选获得不利用硝酸盐 突变体88株。88株突变体在硝酸盐培养基上连续培养7代后得到稳定不利用硝酸盐突变 利用硝酸盐，利用亚硝酸盐和次黄嘌呤；稳定的突变体硝酸盐还原酶活性与野生型相比显 EMS处理2h原生质体得到4株突变体除不利用硝酸 诱变获得的88个突变体中，在109l 盐外，完全不利用亚硝酸盐，利用次黄嘌呤，与前人报道突变体生理表现不一致，为新发 现表型，暂命名为nitX。 变体，其生理表现型为不利用硝酸盐，利用亚硝酸盐和次黄嘌呤；21株突变体在硝酸盐 90．47％；稳定突变体硝酸盐还原酶活性为154．47 og／g．h，比野生型菌株降低了 226．61 gg／g．h。 分析表明编号20．2．17突变体硝酸还原酶基因与虫草白僵菌的硝酸还原酶基因同源性为 99％，具有相同的4个保守结构域；与野生型硝酸还原酶氨基酸比对表明：位于保守域中 氨酸)变突变为V(缬氨酸)。保守区域蛋白的置换至使硝酸还原酶蛋白组成失活导致其他 电子传递链受到影响，确切原因是次黄嘌呤脱氧化酶(NAD)和黄素腺嘌呤脱氧化酶(Ⅳ山) 活性失活，进步控制黄素腺嘌呤二核苷酸脱氧化酶(FADH2)和甲基紫酯还原酶活性，造成 菌株不能利用硝酸盐。结合突变体生理表现与基因序列分析，进一步说明编号20·2-17突 变体为不利用硝酸突变体。 本实验初步建立了球孢白僵菌NR缺陷突变体菌株的诱变、筛选和鉴定方法，为获得 更详细的突变体信息，还需要对突变体进行进一步的筛选鉴定，为最终利用NR基因建立 球孢白僵菌专用筛选标记奠定基础。 关键词：白僵菌，硝酸还原酶，突变体，筛选，鉴定 Ⅱ of Isolation ofnitratereductase．deficientmutants andcharacterizion Abstract Beauveriabassianaisall biocontrolandis important fungi used丽dely．Atpresent,geneengineering becomes choicein markeris for thefirst strains safety veryimportantgenetic improvement．Screening modified Beauveriabassianacouldbeconstructedfor reduetasedeficient organismreleasing．Nitrate this be nitrateassole souroe．In transformantscoulds