鳙鱼中多聚磷酸水解机理及无磷保水剂的研究.pdf

鳙鱼中多聚磷酸盐水解机理及无磷保水剂的研究 摘 要 多聚磷酸盐作为重要的保水剂和抗冻剂在水产品加工中被广泛使用。但是多 聚磷酸盐在添加到肌肉中能够被水解，而降低了其功能特性。本文针对多聚磷酸 盐在水产品中检测及水解等问题进行了研究，以鳙鱼为对象，建立了水产品中多 聚磷酸盐的测定方法，分离纯化了焦磷酸盐水解酶和三聚磷酸盐水解酶，阐明了 多聚磷酸盐水解机理和保水机理，并开发了安全高效的磷酸盐替代品。结论分述 如下： 1．建立了水产品中多聚磷酸盐测定的离子色谱法。利用DionexICS2000型离子色谱， ASI 1．HC型阴离子分离柱，以氢氧化钾为淋洗液，采取程序梯度洗脱可以对单磷酸盐(Pi)、 进行定性定量分析。Pi、PP、TPP在0．005-0．5mmol／L的范围内均呈现良好的线性相关性， 相关系数f20．999，HMP相关系数r2o．99。采用三氯乙酸超声波萃取，在鳙鱼肉中的回收 率为99-111％，能够用以测定鳙鱼和其它水产品中多聚磷酸盐。 2．对不同水产品中多聚磷酸盐的水解规律进行了研究。使用本文建立的离 子色谱法可以准确地测定TSPP和STPP在不同水产中的水解。STPP水解分为两 步，首先被水解成PP和Pi，其次生成的PP被进一步水解成Pi。而添加的TSPP 直接被水解成单磷酸盐。TSPP和STPP中问水解产物PP的水解消弱了其提高肌 肉保水性的功能特性。 ICS 3．本方法利用Dionex 2000型离子色谱，ASll-HC型阴离子分离柱，以 氢氧化钾为淋洗液，采取程序梯度洗脱可以非常准确地测定腺苷三磷酸(ArP)、 与电导值具有很好的线性关系，相关系数均大于0．997。在此基础上建立了鱼肉 Ca-ATPase活性的离子色谱测定法，为ATPase的研究提供了新的方法。 4．对鳙鱼焦磷酸盐水解酶(PPase)进行了分离纯化和生化特性的研究。肌 mol／LKCl-20 肉通过O．05 mmoFL tris—HCI(pH7．0)缓冲液漂洗得到的粗酶液，经 S-300凝胶层析可以得到在nativePAGE和 线性洗脱层析，再经Sephacryl SDS—PAGE图谱上呈现单一蛋白条带的纯化酶。纯化倍数为114．5倍，酶活回收 率为4．5％。 鳙鱼中的PPase的相对分子量为50kDa，是有两个相同的分子量为25kDa 的亚基构成，最适温度和pH分别为50℃和8．0，该酶的热稳定性不强，在pH5．0—10 的范围内有着很好的稳定性。M92+是该酶的必需离子，当M孑+浓度与底物浓度 比值兰1时，酶活性较高且保持稳定。但当底物浓度高于M92+浓度时，底物对 酶活性有一定的抑制作用。C02+和Mn2+对PPase也有一定的激活作用。低浓度 的EDTA可以激活酶，而高浓度的EDTA却能强烈抑制酶活。PPase酶可能为金 属蛋白酶。DTT可以增强酶活性。而柠檬酸钠和亚硫酸氢钠可以强烈抑制酶活。 丝氨酸蛋白酶的特异性抑制剂PMSF可以完全抑制酶活性，该酶可能为丝氨酸蛋 5．本文通过逐层剖析法证明了肌球蛋白头部S．1具有TPPase活性，并阐明 了鳙鱼肌球蛋白头部S-1TPPase的生化特性。 定，在保温60min后仍具有较高的活性，但随温度升高稳定性下降，在700c下 一定的影响，当浓度由0．1m01／L提高到O．3mol／L时TPPase活性迅速升高，但 是当KCl浓度进一步升高时，酶活性趋于稳定不再发生变化。EDTA-Na2能显著 抑制TPPase活力，而Mg”可以缓解这种抑制作用。TPPa∞对于氧化剂和还原 mol／L KCl、5mmol／L 剂都比较稳定。在O．3 Mg”和pH8．0反应体系条件下测定 鳙鱼TPPaSe的米氏常数为3．2rnmol／L。 6．研究了三种多聚磷酸盐对肌原纤维蛋白结构的影响，探讨了提高保水性 的机理。氯化钠在高离子强度下能够破坏鳙鱼肌原纤维结构，使肌原纤维小片化 并溶解。提出了焦磷酸盐提高保水性的机理为：一，通过提高蛋白静电斥力，使 肌原纤维横向膨胀，增加肌原纤维内