球孢白僵菌降解主体壁的几丁质酶和蛋白酶的分子改良.pdf

两南走学祷士擘位论文 舞攀舅皇鼎奠鼍等皇删I—鼎皇曼醴■—裂麓岛■皇鼍嬲量——尊崮嘲嘲—■罾黑蔓量—懋舞鼎皇———篁鼎蔓■■黑舞舞■■皇寰篁■—荆 中文摘要 遐虫蠛躁真蘧具奏主动侵染宿主的黪点，是魍然界昆虫耪群数目的重爱调节 因素，毽蹩黪治潮吸式塞虫秘鹳翅疆裹虫的有效手段，因此其煮广蛹黪应鲻裁豢。 魑是，壹倒害虫时蚓长粒黪效不稳定等软点跟制了您虫痍殿真蔚熨广泛的应髑。 磷究袭鞠，翘虫痪聚囊麓穗丝穿逶终整爨其搜染效瘸数关键步骤。在北过程中， 囊菌装分泌黉蠢酶、尼丁震酶、嚣酶等多释承勰簿采舔解瑟虫体熬，英中凡丁袋 酶和蛋白酶艇有重要作用。 研究表明，在琵盎瘸舔真菌中超爨袭达凡丁缓酶释蛋自酶基因哥戮撬菇蘸株 的毒力。为了述一步提离杀虫凑蓠静防治效聚，零文采蠲DNA shuffling帮结稳域 囡进行分子改良。利用DNA shuffling技术对球孢白僵菌的几丁质酶纂困Bbchitl 进行定向进化，获褥了几丁质酶活性摄商的突交体；通过对不黼来源几丁质结合 域的比较，发现家蚕几丁质结合域与几丁质的结台髓力最强。转基因结果漾孵， 带有象蚕几丁质结合域的融合几丁质酶和融合蛋白酶均可以显藩提高球孢白僵菌 的毒力。浚结果表明，几r质结合域在提高杀虫真菌的毒力上舆谢重要作用。抵 我们掰知，题裁还未有列用DNAshuffling技术提高几丁质酶活牲豹成泌例子，也 未春在黪艇姹虫传戥末瓣戆上添加足丁矮绩食域提鬣昆虫瘸踉舆麓毒力魏摄道。 差要疆究结果如。F： shuffl 1．Bbchitl静DNAlng 1．1以大疑糕蘩为袋示藏DNAshuffl；ng体系的建巍 DNA shuffling中的关键披术是离散筑选体系的建立。本文选择大肠杼越l乍为 襞示菠，嘏器蘩落在炅‘了矮乎板上影缓遮甥骥戆太小簿选凡丁黢酶活性提蠢的突 交体。西娃，在大瑟释蔼中表达静Bbchitl螫须分泌翻滁癸并县骞生物擎滔经。 }＆较了5耱不羁来游豹绩号黢对Bbchitl分泌黪影嫡。结聚表明：】)麓箩b 在周旋空简和服外的累积。在18 4C，腕外Bbchitl静产率是374C的豫倍。穰裕班 上结柴，选用PelB信号腻作为Bbehitl 8。C shuffling筛选体系的前簿觚，并采厢l 低温筛选shuffling文痒。 shuffl i {。2遴避DNA ng簸缮豇丁质酶添性撼鹰姻突变体 经过三轮DNA shuffling，薅选了约1．5×lO’个竞隧，最终获褥嚣个足丁质酶活 中文摘要 表明突变的氨基酸影响了几丁质酶与胶体几丁质的亲和力；shu一1和shu一2的 高的利用效率。 将上述两个突变基因导入球孢白僵菌，生物测定结果表明，与组成性表达野 影响。 i 2．在几丁质酶Bbcht1上添加异源几丁质结合域提高球孢白僵菌 的毒力 2．1不同来源几丁质结合域的筛选与分析 为了分析不同来源几丁质结合域在结合几丁质能力上的差异，分别将来自家 蚕、苦瓜、环状芽孢杆菌、云杉蚜虫和果蝇的5个几丁J质结合域与球孢白僵菌的 几J‘质酶基因Bbch#l相融合，获得了具不同几J‘质结合域的融合几丁质酶。将不 同的融合几丁‘质酶分别转入毕赤酵母进行表达，然后对所得到的融合几丁质酶进 行结合分析。结果表明，具有家蚕几丁质结合域的融合几丁质酶Bbchitl．Bm与几 丁质的结合能力最强。用标记了FITC的几丁质酶进行几丁质结合分析，结果显示 家蚕几T‘质结合域能使融合几丁质酶大量富集在粉末几丁质的表面，使几丁质上 的酶浓度大幅度提高。 2．2融合几丁质酶的酶学特性分析 酶动力学分析表明，融合了家蚕几丁质结合域的融合儿丁酶Bbchitl．Bm的Km 加家蚕儿丁质结合域提高了几uJ质酶对几丁质的亲和力，并增强了几丁质酶降解 几丁质的效率。但对家蚕几丁质结合域进行突变后，融合几