鸭梨多酚氧化酶因克隆及其反义转化的研究.pdfVIP

摘要 在梨果实生产和加工过程中，多酚氧化酶(Polyphenol 在引发了果实的迅速褐变，给果品的外观品质和加工性能带来了严重的影响，己经成 为困扰我国梨果品生产和经营的主要难题之一，生产上急需对其进行性状改良。本研 究以降低原产我国梨品种——鸭梨果实组织内多酚氧化酶含量为目标，围绕着多酚氧 化酶基因开展了基因克隆、序列分析、反义表达载体构建以及遗传转化等一系列研究， 最终获得了低多酚氧化酶活性的转基因鸭梨植株，从而为从根本上解决梨果实褐变问 题、培育抗褐变梨新品种奠定了基础。所取得的主要成果如下所示： 1．根据多酚氧化酶基因保守序列设计一对引物，以鸭梨果实eDNA为模板扩增得 根据得到的eDNA序列开放性读码框设计引物扩增得到鸭梨多酚氧化酶基因DNA序 列，结果显示该基因eDNA序列和DNA序列碱基组成无差异，证实鸭梨多酚氧化酶 基因组成上不具备内含子。 2．对鸭梨多酚氧化酶基因所翻译氨基酸序列进行生物信息学分析，结果表明该氨 基酸序列与其它物种多酚氧化酶高度同源，且包含一个由210个氨基酸残基组成的酪 氨酸酶超级家族保守结构域，具有一个酪氨酸酶CuA结合位点和一个酪氨酸CuB结 合位点，证实鸭梨多酚氧化酶属酪氨酸酶超级家族成员，该酶在发挥酶促作用时需要 CuZ十作为辅因子。 3．基于所获得的氨基酸序列对鸭梨多酚氧化酶进行蛋白空间结构预测，结果显示 鸭梨多酚氧化酶应属于全a．结构的珠蛋白型a．螺旋蛋白：该蛋白的疏水性氨基酸位 于分子内部，亲水性氨基酸位于分子表面，具有可溶性亲水蛋白的典型特征，不具备 跨膜结构，故推测鸭梨多酚氧化酶在细胞中的定位应该位于类囊体腔中。 4．首次构建了鸭梨叶片再生体系，确定鸭梨最佳叶片愈伤组织诱导培养基为 糖309／L+IBA0．5mg／L，生根率和平均根数分别为50％和2．04。 5．首次构建了鸭梨多酚氧化酶基因的反义表达载体。根据所克隆到的鸭梨多酚氧 反向连接后，电转仪法转化农杆菌EHAl05，经酶切和PCR鉴定证实，鸭梨多酚氧 化酶基因反义表达载体构建成功，并已整合到农杆菌上。 6．首次优化建立了鸭梨的遗传转化体系。在鸭梨叶片再生体系的基础上对影响农 杆菌介导遗传转化的各方面因素进行优化，结果显示，当叶盘预培养2天，农杆菌菌 培养基中添加40099／ml的羧苄青霉素抑制残余农杆菌效果最好。 7．首次获得具有反义多酚氧化酶基因的鸭梨转基因植株。应用优化的遗传转化体 系对鸭梨组培苗进行多酚氧化酶基因反义表达载体的遗传转化，共获得卡那霉素抗性 苗4株，经PCR鉴定证实其中1株组培苗中外源基因实现成功转化；对获得的转基 因鸭梨苗进行生根和田间移栽，经Northern杂交和多酚氧化酶活性检测证实，转基因 鸭梨植株体内多酚氧化酶基因转录和翻译水平均得到了明显的抑制。 关键词：鸭梨；多酚氧化酶(即D)；基因克隆；生物信息学分析；反义RNA技 术；遗传转化 for on andAnti—transformation StudyCloning Polyphenol 0xidaseGenein‘Yali’Pear Author：Li Gui-qin Major：Pomology Yu-xing Supervisor：Zhang Abstract After fruitoften causedthe havest，the enzymatibrowningrapidly,it pear get