一种新型ⅱa类酸菌细菌素的重组表达策略研究.pdfVIP

摘 要 一种新型 IIa 类乳酸菌细菌素的重组表达策略研究 学科、专业：工科、食品科学 入学时间：2008 年 9 月 1 日 硕士研究生姓名：谢燕 答辩时间：2011 年 3 月 6 日 指导教师：陈永泉教授 授予学位时间：2011 年 月 摘 要 Ⅱa 类细菌素是乳酸菌细菌素的一个亚类，为抗李斯特氏菌的多肽，对热稳定；可 被人体生物降解和消化，对健康无害，是一类控制李斯特氏菌污染最具潜力的抗菌肽， 对食品保藏具有重要意义。因此Ⅱa 类细菌素的基础研究和应用研究成为近年来的研究 热点。 到目前为止，所发现的 20 多种Ⅱa 类细菌素大多采用传统的筛菌方法和繁琐的分离 纯化得到，存在干扰因素多，产量低，分离纯化困难等问题，故很难再迅速挖掘出新的 Ⅱa 类细菌素。鉴于这类细菌素序列的保守性，利用基因组学和生物信息学来寻找新的 细菌素已成为一种有效的工具；而细菌素的异源表达则克服了产生菌细菌素调控系统的 制约，使其可以连续生产或超量表达。所采用的表达系统主要是大肠杆菌系统、乳酸菌 系统和酵母菌系统，其中大肠杆菌系统最常用，表达的细菌素主要以胞内融合的包涵体 形式存在，其后续的处理过程较为复杂繁琐。近年来，一种无细胞蛋白质合成系统发展 迅速，成功地架起了基因与蛋白质之间的桥梁，能使外源基因在体外快速表达，并且避 免了细胞体系中宿主菌的复杂调控和新陈代谢带来的干扰，以及基因工程菌表达抗菌肽 时对宿主的毒性作用。因此，无细胞蛋白质合成系统将成为Ⅱa 类细菌素重组表达的一 种有效手段。 本文以通过基因组学和生物信息学工具挖掘到的一条潜在的 Ⅱa 类细菌素基因 NB-C1 为研究对象，进行不同策略的重组表达研究，从而实现 NB-C1 基因的高效活性 表达，并对其抑菌活性进行鉴定。首先构建了NB-C1 基因的表达载体 pIVEX2.4d-NB-C1 以及带绿色荧光蛋白（GFP ）和硫氧还蛋白（TrxA ）标签的融合表达载体 pIVEX2.4d-GFP-NB-C1 和 pIVEX2.4d-TrxA-NB-C1 。将各表达载体分别在大肠杆菌系统 （BL21(DE3)和 BL21(DE3)plysS ）和大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统中进行表达，其中 pIVEX2.4d-GFP-NB-C1 在体内和体外系统均成功表达出可溶性的融合蛋白，可溶性蛋白 的表达量分别为体内表达量 840 μg/mL ，体外表达量 730 μg/mL （间歇式反应， Batch-mode ）和2.2 mg/mL(连续交换式反应，CECF-mode) ；pIVEX2.4d-TrxA-NB-C1 在 体内表达的融合蛋白以胞内包涵体形式存在，在无细胞系统中则能实现可溶性表达，但 表达量较低。将体内和体外表达的 GFP-NB-C1 进行 Ni-NTA 亲和层析柱纯化后，分别 得到纯度 95%和 98%的融合目的蛋白 36 mg/L 和 0.26 mg/mL 。以单核增生李斯特氏菌为 指示菌，检测各表达产物的抑菌活性，结果表明可溶性表达的 NB-C1 融合蛋白均表现 出对李斯特氏菌的抑制作用。 I 摘 要 本研究建立了一条从Ⅱa 类细菌素基因到其重组表达获得活性蛋白质的通路，并探 讨了各种表达策略及其表达水平，这为新型Ⅱa 类细菌素基因的挖掘及其重组表达研究 提供了借鉴。 关键词：Ⅱa 类细菌素；NB-C1 基因；无细胞蛋白质合成系统；大肠杆菌；重组表 达 II Abstract Recombinant expression of a novel class IIa