樱桃蕃茄中果胶酶的基因克隆及在毕赤酵母中表达的初步研究.pdfVIP

樱桃蕃茄中果胶酯酶的基因克隆 及在毕赤酵母中表达的初步研究 食品科学专业 研究生葛英亮 指导教师马力 摘要： 低甲氧基果胶在食品、医药等行业有着比高甲氧基果胶更为广泛的作 用。果胶酯酶(Pectinesterase，Pectinesterase。Pectin Methyl demethoxylase orPectin 的生物催化剂，不同来源的果胶酯酶可以迅速的从果胶分子的还原性末端 或者邻近的游离羧基开始，定向攻击甲氧基，进行去甲基化反应，从而达 到将从植物中提取的含量较高的高甲氧基果胶转化为低甲氧基果胶的目 的。果胶酯酶的存在广泛，不但存在于大量的植物中，在一些霉菌和细菌 中也可以分离出果胶酯酶，将其运用在低甲氧基果胶的生产中避免了酸 法、碱法、酰胺化法生产果胶带来的污染大，成本高、循环性差的弊端， 因此，酶法生产低甲氧基果胶成为研究低甲氧基果胶生产方法的热点。 目前，有很多果胶酯酶研究的相关报道，并有在柑桔、蕃茄、豆芽等 生物中成功提取并克隆出果胶酯酶基因的先例，但都并未进一步的分析。 esculentum)不 本研究是选取自种原产于南美洲的樱桃番茄(Lycopersicon 同成熟阶段的果实、项尖嫩叶和花蕾提取樱桃蕃茄的总RNA，通过特异 性引物进行RT—PcR反应，扩增出含有著茄果胶酯酶基因全长的cDNA， 并将其与载体链接，进行序列分析，构建重组表达质粒pPICZaA，转化毕 赤酵母细胞，对毕赤酵母中的外源基因进行甲醇诱导表达，验证转化毕赤 酵母分泌的果胶酯酶的活性，其研究主要过程如下： esculentum)果实、顶尖嫩叶和花蕾中的 1．樱桃番茄(Lycopersicon 总RNA提取和鉴定。 第一链并设计特异性引物进行PCR扩增，获得樱桃蕃茄果胶酯酶基因片 断。 。 3．构建测序载体PT-PEM，提取质粒经过酶切及PCR分析和序列测 定，证明樱桃蕃茄果胶酯酶基因提取成功。 进行PCR反应，确定重组酵母基因中含有果胶酯酶基因片断。 5．对毕赤酵母中外源基因进行甲醇诱导表达，对发酵上清液的果胶 酯酶活性进行测定。 在樱桃蕃茄果胶酯酶基因克隆和在毕赤酵母中表达的试验中，我们 得到了一条长为1942bp的果胶酯酶基因，酶切、电泳、测序，将所得基 for Center 因序列提交美国国家生物技术信息中心(NationalBioteclmology 毕赤酵母中得到重组酵母，对重组毕赤酵母进行甲醛诱导表达，对发酵上 清液进行果胶酯酶活性测定，发现我们表达出来的蕃茄果胶酯酶并不具有 果胶酯酶的活性。 关键词；果胶酯酶基因克隆毕赤酵母表达研究 The ontheGene PreliminaryStudy Cloning ofPectinesteraseofthe Lycopersicon its esculentumandGene inthe Expression Pichia pastoris Food Science Li Author：GE强ng—Li‘mgSupervisor：Ma A