最新分子生物学之常用分子生物学技术的原理及其应用.ppt

基因组文库和cDNA文库的构建和筛选 第一轮筛选 第二轮筛选 第三轮筛选 基因组文库筛选结果举例 cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。 二、cDNA文库 第四节 生物芯片技术 Biological Chip Technique 是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNA microarray)。 一、基因芯片 基因芯片(gene chip) 目录 目录 常用分子生物学技术的原理及应用 The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology 第一节 分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization and Blotting Technique 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。 一、分子杂交与印迹技术的原理 复性 RNA DNA （一）印迹技术 利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。 用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 （二）探针技术 二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA印迹 (Southern blotting) （二）RNA印迹 (Northern blotting) （三）蛋白质的印迹 (Western blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。 用于RNA的定性定量分析。 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 其他： 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip) 三种印迹技术的比较 分子杂交实验 ① ② ③ 放射自显影照片 DNA芯片技术 第二节 PCR技术的原理与应用 The Principle and Application of PCR Technology 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Template DNA 一、PCR技术的工作原理 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 PCR技术原理示意图 PCR的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C 模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ PCR体系基本组成成分 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段； 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段； 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。 二、PCR技术的主要用途 （一）目的基因的克隆 利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。 PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。 （三）DNA和RNA的微量分析 （二）基因突变 将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度； 待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。 PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性 。 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析 逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。 RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知