最新第八章酶定向进化.ppt

第八章 酶定向进化 天然酶的应用及局限性酶的定向进化的思想酶的定向进化的策略和方法酶的定向进化技术的展望  生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中,并维持其独立性和生命的延续性,都是因为生物体内的一系列酶在发挥着作用.酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得以按照预定的方向有序,精确而顺利地进行,几乎所有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关,可以这样说,没有酶的存在,就没有生物体的一切生命活动.  天然酶的应用 利用酶作为催化剂进行生物催化与生物转化,已成为生产精细化学品,手性药物,食品添加剂等的重要工具,获得了广泛应用.随着酶催化应用范围的不断扩大和研究的逐步深入,研究者发现,酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求,而且天然酶的稳定性差,活性低使催化效率很低,还缺乏有商业价值的催化功能 天然酶的局限 天然酶的局限性源于酶的自然进化过程. 现代生物工程的要求 能具备长期稳定性和活性能适用于水及非水相环境能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物的原材料 如何利用相对简单的方法以达到对天然酶的改造或构建新的非天然酶就显得非常有研究意义和应用前景. 1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶分子的定向进化的概念,并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶. 定向进化 定向进化是模拟自然进化的过程，进行人工随机突变，并在特定的环境条件下进行选择，使进化朝着人们所需要的方向发展的技术过程。 分为分子定向进化和细胞定向进化 细胞定向进化 细胞定向进化是在细胞水平上进行定向进化的过程，以各种细胞为进化对象，目的是改良细胞的各种特征，主要包括微生物细胞的定向进化、动物细胞的定向进化、植物细胞的定向进化等。 随机突变方法有全基因组重排技术。 基因组重排技术通过把诱变与细胞融合技术相结合，对细胞进行基因组重排，从而大幅度增加细胞的正突变频率。 分子定向进化 分子定向进化是在分子水平上进行定向进化的过程。 分子定向进化首先要通过从细胞内提取或者通过PCR等方法获得目标分子的基因，在体外采用易错PCR 、ＤＮＡ重排、基因家族重排等技术进行人工突变，然后进行定向选择而获得所需突变体。 酶分子定向进化 简称酶定向进化，是模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特征的酶的突变体的技术过程。 酶定向进化的基本过程 随机突变、构建突变基因文库、定向选择 酶定向进化的基本过程： 随机突变的策略易错PCR技术(error-prone PCR)DNA改组(DNA shuflling):由美国Stemmer 于1994 年首次提出 一项体外重组技术 随机引发重组(RPR) 1998 年,Arnold 提出了一种有效的新方法 交错延伸技术(StEP):由Zhao 等 提出, 是一种简化的DNA shuffling 技术 基因家族重排技术  酶定向进化的特点 1 适应面广 2 目的性强 3 效果显著 第二节 酶基因的随机突变 体外随机突变的方法：PCR技术、DNA重排技术、基因家族重排技术 基因随机突变方法的特点P207表8－1 随机突变方法可以联合使用，交叉进行，通过多次试验，反复筛选，以完成对酶的定向进化。 一 易错PCR技术 在PCR技术的基础上，通过改变反应条件，增加碱基配对错误的出现频率，就成为易错PCR技术。 可以通过提高镁离子浓度、添加一定浓度的锰离子、改变4种底物（dAMP、dTMP、dCMP、dGMP）的浓度比等反应条件，使DNA聚合酶在催化基因扩增时，增加碱基配对错误的出现频率，而引起基因突变。 特点 正突变的概率低，突变基因文库较大，文库筛选的工作量大，一般适用于较小基因的定向进化。 二 DNA重排技术 概念：又称为DNA改组技术，是从正突变基因文库中分离得到的同源DNA，用酶切割成随机片断，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。 DNA重排技术的基本过程 DNA重排技术将两条或多条正突变基因通过脱氧核糖核算酶Ⅰ（DNase Ⅰ)等酶的作用，随机切割成若干DNA片断，然后将这些随机片断在不加引物的条件下经过多次PCR循环，使这些DNA随机片断互为模板和引物进行扩增、延伸，再加入适宜的引物进行PCR反应，获得全长基因。 这些全长基因由于是在不加引物的条件下由DNA随机片断互为模板和引物扩增而成的，其碱基序列经过重新排布而形成众多的突变基因。 1）交错延伸PCR技术：在同一个反应体系中以两个或多个相关的DNA片断为模板进行PCR