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水牛性别控制相关问题的研究 摘要 中国拥有超过两千万头沼泽型水牛，但绝大多数只能作为役用，若能通 过性别控制技术将其快速改良成乳用或乳肉兼用的杂交水牛，将能带来巨 大的经济和社会效益。本论文利用流式细胞仪分离水牛x和Y精子法进行水 牛性别控制研究，以期建立和完善水牛性别控制技术体系，并应用到水牛 繁殖、育种的研究和生产实践，加速水牛品种改良工作进展。具体研究内 容分为如下五个部分： 研究一，分析和鉴定水牛X精子和Y精子DNA含量的差异，为进行分离 水牛XY精子性别控制研究提供理论基础。 研究结果显示，摩拉水牛的x精子和Y精子的DNA含量差别为3．59± 个品种之间没有显著差异(P0．05)，但是品种内的牛个体之间有差异 的可行性。 研究二，对水牛精子分离之后的体外存活能力、顶体完整情况及微生 物污染等精液品质相关参数进行系统分析，以了解影响水牛分离精子活率 和受精能力的因素，为改进水牛精子分离方法及提高其在IVF和础应用效 率提供参考。 研究结果表明，流式细胞仪法、荧光显微镜法与精子图像分析仪法检 测所得精子活率的相关系数大于O．85，相关性非常显著，表明均能有效评 定精子活率。对分离精子品质分析结果表明，新鲜水牛精子经过分离后， 33．9％， 过冷冻解冻后，分离精子的活率高于未分离精子的活率(44．1％vs 一孵育时间的分离精子活率均高于未分离精子活率(PO．05)。在项体反应方 面，新鲜水牛精子经过分离后，顶体损坏的精子也被去除，发生顶体反应 明分离精子受冷冻损伤更严重。解冻并体外孵育3h、6h后，分离精子顶体 反应比例分别为33．9％、38．3％，未分离精子顶体反应比例分别为32．8％、 35．6％，同一孵育时间的分离精子顶体反应率稍微高于未分离精子，但无统 计差异(P0．05)。 精液微生物分析试验结果表明，新鲜采集的水牛精液平均菌落密度 10619个／毫升，常规冻精平均菌落密度为293个／毫升，而分离冷冻精液平 菌落中，革兰氏阳性球菌占48％，’阴性杆菌占41％，阳性杆菌占9％，霉菌 占2％；而分离精子冷冻精液中的菌落100％为革兰氏阴性杆菌，经检测确 定为阴沟肠杆菌和产酸克雷伯氏菌，对妥布霉素和庆大霉素呈耐药性，而 对丁胺卡那霉素以及环丙氟哌酸药物敏感性较强。 研究三，通过制作奶牛性染色体涂染探针，检测水牛分离精子的纯度， 以期建立一种独立评估水牛分离精子纯度的手段。 研究结果表明，运用显微操作仪能够有效分离荷斯坦奶牛的性染色体 并制作探针。应用荷斯坦奶牛Y染色体探针杂交水牛正常精子显示，Y精 子比例为47．7％；应用荷斯坦奶牛X染色体探针杂交水牛正常精子显示，X 针用于鉴定XY精子比例的有效性。在杂交水牛分离精子中，应用Y染色 体探针杂交水牛分离Y精子样本表明，Y精子所占的比率为82．2％；应用 X染色体探针杂交水牛分离Y精子样本表明，X精子所占比例为9．6％，也 即Y精子所占的比率为90．4％。两种探针检测分离Y精子的综合纯度为 86．2％，与流式细胞仪重分析87％的结果接近(PO．05)。 研究四，将水牛分离精子应用于活体采卵(OPU)和体外受精(IVF) 技术体系，以提高水牛分离精子生产优良性控胚胎和后代的效率。 试验结果表明，在水牛卵母细胞体外成熟培养中添加瘦素不但能有效 促进水牛卵母细胞成熟，而且提高其体外成熟的质量及受精后的胚胎发育 潜能，其中以成熟培养液中添加10ng／mL的效果最为明显，卵母细胞成熟 发现，在胚胎培养液中添加瘦素有助于促进水牛IVF胚胎的发育，其中以 10n∥mL的效果最为明显，囊胚发育率达到26．1％，与不添加瘦素的对照组 17．5％的囊胚率有显著差异(PO．05)。此外，在成熟液和胚胎培养液中同时 加10n∥mL的瘦素，虽然IVF后卵母细胞的分裂率和囊胚率都有一定提高， 但是与对照组没有统计差异(P0．05)。 在0PU．IVF研究中，OPU得到的水牛卵母细胞与分离精子和未分离精 分离精子IVF后的囊胚率为15．3％，稍微低于未分离精子19．1％，但二者也 离和未分离精子与OPU来源卵母细胞IVF生产的冻胚移植受胎率分别为 生产的胚胎移植数据合并分析显示，冻胚的总体受胎率(13．4％)显著低于鲜 X精子与0PU卵母细胞生产的体外性控胚胎移植后，产下1