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水牛诱导多能干细胞的研究 摘要 体细胞诱导为多能干细胞是一种获取多能干细胞的新方法，即采 用特异性转录因子，将体细胞重编程为具有于细胞特性的诱导多能干 stem 细胞(induced cells，iPSCs)，为胚胎干细胞建系困难 pluripotent 的家畜提供一种获得多能干细胞的新途径。水牛是我国南方的主要家 畜，除了为人类提供肉食和役用之外，其水牛奶营养丰富，是优质的 奶源之一。但是，水牛的产奶量低，其各方面的生产性能需要改进。 采用干细胞介导的转基因克隆技术可以实现定点打靶转基因操作，是 提高水牛生产性能的先进遗传改良技术之一。但是，关于水牛干细胞 多能性相关的信号路径和培养条件等研究甚少，水牛胚胎干细胞的建 系困难，要应用于基因打靶技术还存在诸多困难。因此，对水牛iPSCs 这种新型多能干细胞的研究显得尤为重要。本研究首次采用逆转录病 和Lin28，对水牛成纤维细胞(BFFs)重编程为水牛诱导多能干细胞 行系统的探讨，以期为研究水牛干细胞信号通路和水牛遗传改良奠定 基础。同时，本研究也利用iPSCs相关转录因子在物种间的高度保守 性，使用水牛源的转录因子，对兔成纤维细胞(RFFs)重编程为兔 诱导多能干细胞(耻PSCs)的方法和生物学特性等进行探索，为iPSCs 应用于人类再生医学提供动物模型，同时也为兔遗传改良提供的手段 之一。 l、克隆和分析了水牛iPSCs相关的六个转录因子。 采用RT-PCR的方法，从水牛胎儿生殖嵴和小肠组织获取水牛 OSKMNL的编码序列(CDS)。SV40T largeantigen(T)的编码序列 采用同样方法从293T细胞获取。测序结果表明，OSKMNLT的基因 8bp 和2130bp。同源性分析表明，水牛OSKMNL氨基酸序列与牛、猪、 人和鼠相应序列具有高度的保守件，同源性分别为：Oct4(98％、96％、 69％署n 从水牛基因组中分段扩取Oct4和Nanog的基因组全长DNA序列。 测序后拼接结果表明，水牛Oct4全长4508bp，包括5个外显子和4 个内含子；Nanog全长4473bp，包括4个外显子和3个内含子。 2、构建了不同的逆转录病毒载体和摸索出适合于生产水牛iPSCs 的病毒系统。 标记基因，探索出能高效感染BFFs，用于生产水牛iPSCs的逆转录 病毒系统和操作体系；同时，构建携带水牛特异性转录因子的逆转录 病毒载体，建立生产iPSCs的小鼠模型，为水牛iPSCs的生产提供实 验平台。结果表明，pMX介导的逆转录病毒系统所生产的假病毒感 更适合用于生产水牛iPSCs；超速离心后的重组假病毒，可以提高感 和c．Myc可以将小鼠成纤维细胞重编程为iPSCs，碱性磷酸酶染色呈 阳性，成功建立iPSCs小鼠模型；构建用于生产水牛iPSCs的逆转录 T (LT为SV40 large “hT”)。 3、优化了水牛iPSCs诱导体系，并探索抑制p53表达来提高水 牛iPSCs诱导效率。 根据生产iPSCs常用的转录因子组合，探索出生产水牛iPSCs的 转录因子组合。同时，在最佳组合条件下，探索SV40 Tantigen large 和p53抑制剂等提高重编程效率的可行性。将AP染色着色较深的 iPSCs克隆视为统计对象的阳性克隆。结果显示，OSKM组合得到21 III 和人端粒酶逆转录酶hTERT可以显著提高AP阳性克隆数，特别是 感染后的BFFs，采用201AVI d， 可以将AP阳性克隆数提高到67个。水牛iPSCs体外扩增发现， 化状态和正常的核型，而其它组合只能传至4．6代。TaqMan定量PCR 同一时期OSKM中的表达量。因此，OSKM组合能将水牛的体细胞 重编程为多能干细胞；