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水产示范中心 实验四 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳 目的 1、掌握电泳的基本原理,了解其他电泳类型 2、掌握电泳的基本操作 原理 醋酸纤维薄膜电泳(CAME)是以醋酸纤维薄膜(CAM)作支持物的一种区带电泳技术 将血清样品点样于醋纤膜上，在pH8．6的缓冲液中电泳时，血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋白组分等电点不同而致表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。 电泳后，CAM经染色和漂洗，可清晰呈现清蛋白、α1、α2、β、γ—球蛋白5条区带。 器材 1．醋酸纤维薄膜(8X2mm) 2．点样器 3．染色皿，漂洗器，镊子 4．电泳仪：直流电源整流器，水平电泳槽 试剂 1．巴比妥缓冲液(pH8.6 I=0.06)：取巴比妥钠12.76g，巴比妥1.66g，加蒸馏水加热溶 解后稀释至1升。 2．氨基黑10B染色液：取氨基黑10B0．5g，甲醇50ml，冰醋酸l0ml，加水至100ml。 3．漂洗液：95％乙醇45ml、冰醋酸5ml、蒸馏水50ml 操作-准备 1.醋纤膜的准备：距离边缘1.5cm用铅笔作好标记，粗糙面用于点样，然后将薄膜放进缓冲液中，自然浸润，约20分钟。 2．电泳槽的准备：水平放置，将缓冲液注入电泳槽中，两边的缓冲液高度要一致，架上滤纸桥，盖上电泳槽盖。 3．点样：将充分浸透(指膜上没有白色斑痕)的薄膜取出，用滤纸吸去膜上过多的缓冲液，载玻片蘸取血清(约10-20p1)，垂直印在CAM粗糙面的加样线上，待样品全部渗入薄膜内后，移开点样器。 操作-电泳 4．加样后，将薄膜条架于支架两端，点样面朝下，点样侧置于负极端。薄膜应平直无弯曲，加上槽盖平衡5分钟后通电电泳。 5．正确连接电泳槽与电泳仪对应的正负极，开启电源通电。电压10-15V/cm膜总宽。电泳40~60分钟，泳动距离约达3.5~4.0cm时即可断电。 6．染色:电泳完毕后断电，用镊子取出薄膜条投入染液5-10分钟，染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使染色充分。 7.漂洗 :从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液，投入漂洗皿中反复漂洗，直至背景漂净为止。此时清晰可见5条色带，待干。 实验报告 将薄膜条粘贴于实验报告.完成实验报告. (本实验结束后,电泳槽内的缓冲液不要倒掉;染色液需要回收) 本周值日:第四组 附录:其他电泳实验简介 聚丙烯酰胺凝胶电泳-垂直电泳 如SDS琼脂糖水平电泳槽 DNA琼脂糖电泳图谱 双向电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳-垂直电泳 SDS琼脂糖水平电泳槽 DNA琼脂糖电泳图谱 双向电泳 安玛西亚双向电泳系统 双向电泳图谱 * * 图4.8 BL21(DE3)/ pET-28a-PPbe1533表达产物的SDS分析 Figure 4.8 SDSanalysis of proteins from BL21(DE3)/ pET-28a-PPbe1533 注：M为marker, Lane1为BL21(DE3)/ pET-28a; Lane2为BL21(DE3)/ pET-28a-1533没加IPTG; Lane3-8为BL21(DE3)/ pET-28a-1533在1mM IPTG诱导1h,2h,3h
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